[发明专利]预防不同血清群问号钩端螺旋体感染的通用型三价基因重组疫苗及其制备方法

权利要求书

1.预防不同血清群问号钩端螺旋体感染的通用型三价基因重组疫苗，其特征在于所述融合基因lipL32/1-lipL21-ompL1/2的核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。

2.根据权利要求1所述的预防不同血清群问号钩端螺旋体感染的通用型三价基因重组疫苗，其特征在于所述融合基因lipL32/1-lipL21-ompL1/2的柔性肽序列如SEQ ID NO：4所示。

3.预防不同血清群问号钩端螺旋体感染的通用型三价基因重组疫苗的制备方法，以问号钩端螺旋体外膜脂蛋白LipL32/1、LipL21和穿膜蛋白OmpL1/2为抗原，采用基因工程技术构建lipL32/1、lipL21和ompL1/2的人工融合基因lipL32/1-lipL21-ompL1/2及其原核表达系统，采用提纯的同时含三种不同蛋白分子重组表达产物rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2为抗原的问号钩端螺旋体基因工程疫苗。

4.根据权利要求3所述的预防不同血清群问号钩端螺旋体感染的通用型三价基因重组疫苗的制备方法，包含以下的步骤：1)问号钩端螺旋体lipL32/1、lipL21和ompL1/2基因的克隆和测序；2)lipL32/1-lipL21-ompL1/2人工融合基因及其原核表达系统构建和测序；3)含IPTG的LB培养基中诱导三价重组蛋白抗原分子rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2表达，SDS-PAGE和BioRad凝胶图象分析系统确定表达情况和产量；4)Ni-NTA亲和层析法提纯rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2；5)rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2与氢氧化铝(alum)混合后组成可注射疫苗剂型。

5.根据权利要求4所述的预防不同血清群问号钩端螺旋体感染的通用型三价基因重组疫苗的方法，其特征在于：所说的融合基因rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2与氢氧化铝混合液直接制备成注射液。

6.根据权利要求4或5所述的预防不同血清群问号钩端螺旋体感染的通用型三价基因重组疫苗的方法，其特征在于问号钩端螺旋体lipL32/1、lipL21和ompL1/2基因的克隆方法是：1)取用问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株，将其接种、培养后离心收集问号钩端螺旋体沉淀；2)分别取离心沉淀的问号钩端螺旋体，用苯酚、-氯仿、提取、乙酸钠和无水乙醇沉淀获得基因组DNA；3)以问号钩端螺旋体基因组DNA为模板，采用PCR分别扩增lipL32/1、lipL21和ompL1/2基因，各上下游引物序列中均分别设置限制性核酸内切酶位点Nde I和XhoI；4)PCR产物经电泳后，在紫外线下观察目的DNA扩增条带；5)采用PCR产物纯化试剂盒，先提取目的DNA扩增条带；然后采用T-A克隆试剂盒，用T4 DNA连接酶将提纯的DNA条带与克隆质粒如pUC-M-T连接；6)取用大肠杆菌DH5α株，将其接种、培养，然后收集细菌沉淀，制备成感受态E.coli DH5α悬液；7)在上述感受态E.coli DH5α悬液中加入上述连接产物，加入SOC培养液培养；8)在LB琼脂平板上涂布接种上述SOC培养物；9)选取SOC培养物上的白色菌落在含LB培养液中培养，采用细菌质粒提取试剂盒进行质粒提取，提取的质粒进行Nde I和XhoI酶切、电泳分离，在紫外线下分别确认有目的DNA片段lipL32/1、lipL21或ompL1/2后，测定克隆片段的核苷酸序列，序列正确者即为重组质粒pUC-M-T^lipL32/1、pUC-M-T^lipL21或pUC-M-T^ompL1/2。