[发明专利]一种肝脏靶向性的基因工程干扰素及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物制药领域。本发明涉及一种基因工程干扰素。具体而言，本发明涉及经半乳糖基修饰的基因工程干扰素及其制备方法，该基因工程干扰素具有明确的靶向肝脏的特性。

发明背景

干扰素(Interferon，IFN)是临床用于治疗病毒性肝炎的常用药物。普通干扰素在体内半衰期短，需反复多次给药，导致患者生理及经济负担加重，并且容易引发副反应，限制了其临床应用。

对于IFN这类具有生理或药理活性的生物活性蛋白，通常采用缓释、化学修饰和基因工程改造等手段来改善其生物活性。例如罗氏和先灵葆雅的PEG化干扰素、白蛋白融合干扰素均具有较长的半衰期；美国专利US4695623和US4897471设计的复合干扰素，可使用3-5倍于普通干扰素的剂量而副反应没有增加。

然而，无论是普通干扰素还是长效干扰素，其在肝脏的分布均不到给全部给药剂量的10％，不得不依靠加大给药剂量来弥补肝靶向性较差的不足。提高干扰素向肝脏的运输，减少干扰素与其它器官的结合，对于增强其治疗效果、减少副反应将具有很大的益处。

利用肝脏中特异的去唾液酸糖蛋白受体识别药物中的半乳糖组分，来提高药物肝靶向性的研究已有报导。中国专利申请CN1087093A就采用半乳糖化学修饰的方法来提高干扰素的肝靶向性；申请号为200810021401.X的中国申请中则采用向干扰素融合的白蛋白上加入半乳糖的方式，来提高其肝靶向性。但是，这些改造方式均属于人工分子改造，改造后蛋白分子与天然分子的差异较大，因此可能会引发人体较强的免疫反应，不仅影响其治疗活性，而且往往会带来很强的副反应。

众所周知，天然干扰素多属于糖蛋白。因此如果能够通过基因工程方法，改变干扰素分子中糖基化修饰糖链类型或结构从而改变干扰素的靶向特性，则能够最大限度减少免疫原性的引入。并且通过基因工程方法获得的糖基修饰工程化干扰素还具有分子高度均一的特点，这对于生物技术药物的成药性而言至关重要。

本发明人通过大量研究，借助基因工程手段，实现在干扰素修饰糖链的末端引入特定的糖基，使改造后的干扰素与肝脏上相应受体具有更高的结合能力，从而实现提高其肝靶向性的目的。

发明内容

本方面旨在提供一种肝靶向性的基因工程干扰素。

本发明基于以下设计原理：天然IFN-β含有166个氨基酸，在Asn80处存在一个N-糖基化位点(Asn-Glu-Thr)，因此在Thr上连有N-修饰糖链；同理，将IFN-α1分子中位于Asn34下游的Arg36突变为Ser，则可在突变后的Ser上引入一个N-糖基化修饰糖链。在此基础上，通过改变干扰素分子中糖基化修饰糖链类型或结构来改变干扰素的靶向分布特性，利用糖基工程化的毕赤酵母作为表达宿主菌，实现在干扰素修饰糖链的末端引入特定糖基如半乳糖分子，使其具有GalGlcNAcMan₅GlcNAc₂或Gal₂GlcNAcMan₅GlcNAc₂的结构，改造后的干扰素与肝脏非唾液酸受体具有更高的结合能力，从而实现提高其肝靶向性的目的。

一方面，本发明提供了一种半乳糖基化基因工程干扰素，所述干扰素用基因工程方法生产，为具有N-糖基化修饰的糖蛋白，修饰糖链末端为半乳糖残基。

所述基因工程干扰素中的N-糖基化位点可以是天然存在的，或者通过突变引入。

在本发明的一个技术方案中，其中所述的干扰素为干扰素β，其氨基酸由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列编码。

其中所述修饰糖链具有GalGlcNAcMan₅GlcNAc₂或Gal₂GlcNAcMan₅GlcNAc₂的结构特征。

另一方面，本发明提供了一种制备所述基因工程干扰素的方法，该方法包括：

a)根据毕赤酵母密码子偏嗜性设计并合成编码所述干扰素蛋白分子的cDNA；

b)将所述cDNA克隆至表达载体，并导入毕赤酵母中构建表达工程菌；

c)诱导所述工程菌表达重组干扰素；

d)从培养液中纯化重组干扰素。

在本发明的一个实施方案中，其中所述的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明的优点在于：

1.本发明提供的基因工程干扰素在性能和生产方式上均区别于传统的干扰素，在靶向性和安全性上比传统干扰素更具优势。