[发明专利]一种生产铁皮石斛的方法

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种生产铁皮石斛的方法，具体涉及运用植物组织培养技术生产铁皮石斛的方法。

背景技术

铁皮石斛(Dendrobium candidum Wall.ex Lind1.)为兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium)多年生附生草本植物，又名黑节草，是我国濒危珍稀的中药材。早在东汉时期的《神农本草经》中已记载石斛“主伤中、除痹、下气、补五脏虚劳赢瘦、强阴、久服厚肠胃”。成书于一千多年前的道家医学经典《道藏》将铁皮石斛列为“中华九大仙草”之首，有“千金草”之称。现代药理学研究表明，铁皮石斛含有的多种有效成分，具有抗肿瘤、降血糖、降血压、降血脂，以及抗氧化和抗诱变等作用。

由于铁皮石斛属于附生药材，植株20～30cm高，生长十分缓慢，在自然条件下种子萌发率低于5％。因此，在通常的栽培条件下，铁皮石斛由种子到开花需要3～4年，而且需要与某些真菌共生才能萌发，很难有实生苗栽培。而传统的分株扦插等无性繁殖方式的成活率低、生长速度慢、繁殖率低，加之近年来人们对野生铁皮石斛资源的掠夺式采挖，其生境被严重破坏，致使野生铁皮石斛濒临灭绝。

研究发现，通过铁皮石斛拟原球茎的生长增殖，来生产大量拟原球茎，获取其药用成分是可行的。铁皮石斛拟原球茎(protocorm-like bodies，即PLBs)是正在生长分化的体细胞胚胎，具有与原植株相同的物质代谢和形态发育潜能。通过拟原球茎的增殖分化，生产大量的组培苗，使铁皮石斛实现低成本高效率的繁殖，是目前解决铁皮石斛资源短缺的主要途径之一。

野生铁皮石斛已作为濒临灭绝的植物种受到世界以及我国政府的重点保护，严禁采摘。为此研究铁皮石斛拟原球茎的培养，实现产业化显得十分重要。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种生产铁皮石斛的方法，以克服铁皮石斛资源短缺的问题。

本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明所提供的是一种固体组织培养铁皮石斛拟原球茎的方法，它包括如下步骤：

(1)无菌苗的选择和处理

从无菌瓶中取出株高约3～10cm的种苗，无菌条件下用解剖剪刀将植株的茎剪成1cm长的带节的外植体，叶或根剪成1cm长的外植体。

(2)拟原球茎的诱导和增殖

将切好的外植体平放接种到拟原球茎诱导培养基中，每个组合接10瓶，每培养瓶接种5个外植体。诱导和增值培养基为MS+蔗糖20g/L+琼脂4.5g/L+NAA 0.5mg/L+6-BA 2mg/L。调整pH为5.8。控制培养温度为(25±1)℃，光强50μmol·m^-2·s^-1，每天光照12h。

(3)拟原球茎继代培养方法

将诱导出的拟原球茎在原诱导培养基中继代一次后，转入继代培养基上继代培养，培养条件MS+NAA 1.0mg/ml+6-BA 0.5mg/ml+蔗糖20g/L+琼脂4.5g/L，光照时间12h/d，光强100μmol·m^-2·s^-1，培养温度：25±1℃，pH＝5.8。

作为本发明固体组织培养铁皮石斛类原球茎的方法更优化的技术方案，对培养基的配方比例和培养条件进行优化选择。

所述的拟原球茎诱导和增值培养：培养周期：20～40天，培养温度：20～30℃，光照时间：8～24小时/天，光照强度：50～80μmol/m^-2·s^-1；所述的诱导培养基为：MS培养基+蔗糖20～30g/L+琼脂4～6g/L+α-萘乙酸2.0～3.0mg/L+6-苄氨基嘌呤2.0～3.0mg/L，pH值为5.5～6.5；

所述的继代培养：培养周期：20～40天，培养温度：20～25℃，光照时间：8～24小时/天，光照强度：50～80μmol/m^-2·s^-1；所述的大规模培养基为：MS培养基+蔗糖30～40g/L+琼脂4～6g/L+α-萘乙酸2.0～3.0mg/L+6-苄氨基嘌呤2.0～3.0mg/L，pH值为5.5～6.5。

继代培养是本发明的重要技术环节，包括如下步骤：

(1)选取颜色鲜绿，生长同步、迅速的拟原球茎转接在继代培养基上；