[发明专利]一种伊枯草菌素A的制备方法

说明书

所属领域

本发明属于抗生素及表面活性剂生物化学工程技术领域，具体涉及一种微生物发酵产生的一种具有表面活性剂性质和抗菌活性的伊枯草菌素A(Iturin A)的分离提取方法。

背景技术

Iturin A是Delcambe和Devignat在1957年从土壤中分离到的一种Bacillussubtilis菌产生的一类具有表面活性剂性质和抗菌活性的同系物，其结构如下：

Iturin A是最早最著名的来源于微生物的生物表面活性剂之一。与普通表面活性剂相比，微生物表面活性剂具有降低表面张力，稳定乳化液和增加泡沫等作用外，还具备一些表面活性剂所不具备的无毒、生物降解性和更强的表面和界面活性、对热的稳定性、对离子强度的稳定性、破乳性、在极端pH下也有效等优点。微生物表面活性剂的这些特点尤其适用于石油工业和环境工程。如石油的降解、提高原油的采收率、重油污染土壤的生物修复等。另外来源于微生物表面活性剂作为天然添加剂，在食品工业、精细化工、化妆品、纺织制造业、除污剂以及农业方面都有广泛的应用。

此外，Iturin A可以抑制部分细菌，但是却表现出强烈的抑制真菌作用，许多研究结果表明它可以抑制绝大多数的真菌和酵母。Iturin A是一种具有广谱抗真菌活性的抗菌多肽，可广泛用于防治各种作物、蔬菜和瓜果的真菌病害[1]，具有稳定性好、抑菌持久、不易产生抗药性和对环境安全等优点，因此Iturin A是一种极具研究开发价值和应用前景的新型生物农药。

但是，微生物发酵生产Iturin A仍处于实验室阶段。要实现大规模工业化生产，不仅要提高微生物发酵生产Iturin A的效价，而且怎样从发酵液中简便、有效的提取Iturin A，也是一个需要解决的重要问题。因为发酵液中的成份极其复杂，除了含有目标产物IturinA外，还含有颗粒极小浓度很高的菌体、部分大分子蛋白及未耗尽的培养基等杂质。不论是对发酵液中Iturin A进行浓缩，制成高浓度的母液，还是将Iturin A提取出来，菌体分离是从发酵液中提取Iturin A不可缺少的单元操作，直接影响IturinA提取的收率和质量，特别是对精制工序起着十分重要的作用。这是因为用传统的过滤除菌法效率低，而且劳动强度大，甚至出现过滤分离时，由于菌体直径小，且易与蛋白质、糖类等形成粘状滤饼阻塞过滤器，使过滤操作无法进行的情况。而使用离心的方法去除菌体与蛋白，尽管也能达到所需效果，但设备价格昂贵、操作运行复杂、投资大、能耗高、工厂生产成本高。

由于发酵液的絮凝过程简单，絮凝后固液分离的效果又往往比较好，因此发酵液的分离常常采用絮凝方法。例如，本杰明.R.克努森等发明的真菌胞外产物絮凝法(CN1902321A)，专利CN1916179A涉及的磁聚物絮凝预处理L-乳酸发酵液方法等。所报道和公开的絮凝方法主要涉及真菌发酵液的分离，细菌发酵液的絮凝方法较少，涉及的iturin的提取制备仅仅是直接与菌体混合提取(JP277873，CN1685056A，CN101143896A，CN1237346A)。此外，由于不同的发酵液的理化性质差异较大，要达到最佳的分离效果需要找到一种有效的絮凝剂和絮凝参数，尤其是分离具有生物活性的化合物。

发明内容

本发明人通过诱变获得一株高产Iturin A的高产菌株枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis ZK-H6菌种，其已于2009年2月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.2897，并且成功进行了5升、50升和1000升发酵罐的发酵实验。本发明目的在于提出一种采用絮凝剂预处理Iturin A发酵液，从发酵液中浓缩和提取Iturin A的方法。

将能够产生Iturin A及其同系物的细菌在一级液体培养基中培养，作为种子液；将在上述第一级液体培养基中培养好的种子液接种到第二级液体培养基中培养，第二级液体培养基接种第一级种子液后在一定温度下培养一段时间，例如，在26℃-37℃发酵培养4-30小时。