[发明专利]短小芽孢杆菌及其培养方法和用途

说明书

技术领域

本发明属于生物农药技术领域，涉及一种用于防治水稻纹枯病的新菌株，特别涉及一株用于防治水稻纹枯病的芽孢杆菌(Bacillus sp.)及其抗菌活性物质的制备方法。

背景技术

水稻是世界上仅次于小麦的第二大粮食作物，全世界超过50％的人口都以稻米为主食，因此发展水稻生产对于保障全球粮食平稳生产与供应具有十分重要的意义。水稻纹枯病发生面积广、流行性强且频率高，其所致损失往往超过稻瘟病，成为水稻稳产高产的严重障碍。如何有效控制水稻纹枯病的发生与危害、加强对该病的防治和保障水稻稳产高产已经引起了人们的广泛关注。

随着水稻纹枯病病害的加重，国内外对该病的防治技术等做了较多的工作，取得了一些研究成果，但至今尚未发现对水稻纹枯病的高抗品种(可能不存在基因对基因的抗性品种)，且该病对国内的主要防治药剂——井冈霉素已产生一定的抗药性(胡秀荣，许文耀，吕伟成等，2006)；从而导致用药周期逐渐缩短，用药量也增加到二十年前的三到四倍(陈志谊等，2000)；因此，利用拮抗微生物开发防治纹枯病的药剂已引起人们的重视。近年来，先后发现了一些对水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)有拮抗作用的真菌、细菌和放线菌，其中研究得最多的是枯草芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌、腊质芽孢杆菌、假单孢菌属和木霉菌属。其中，芽孢杆菌属拮抗微生物，目前基本上与井冈霉素等农药混合制成微生物复配农药，其它拮抗微生物用于纹枯病的生物防治尚处于试验研究阶段，有待进一步开发。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种能用于防治水稻纹枯病的短小芽孢杆菌及其培养方法和用途。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种短小芽孢杆菌，保藏名称为：Bacillus pumilus223，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国 武汉 武汉大学；保藏日期：2010年4月8，保藏号：CCTCC NO：M2010075。

本发明还同时提供了上述短小芽孢杆菌的培养方法，包括如下步骤：

1)、固体平板培养：用接种环蘸取Bacillus pumilus 223CCTCC NO：M2010075在PDA固体培养基上划线接种，于35℃培养12h，得到菌种I；所述菌种I能在4℃下保存3个月；

2)、液体摇瓶培养：取一环菌种I接入装有100ml PD液体培养基的容器中，于35℃、200r/min培养12h，得到菌种II；所述菌种II为Bacillus pumilus 223 CCTCC NO：M2010075。

作为本发明的短小芽孢杆菌的培养方法的改进：

PDA固体培养基的制备方法如下：将土豆200g加800ml水煮沸30min，用纱布过滤，得滤液；在所得滤液中加入葡萄糖20g和琼脂18g，加水至1000ml，自然pH，121℃灭菌20min，得PDA固体培养基；

PD液体培养基的制备方法如下：将土豆200g加800ml水煮沸30min，用纱布过滤，得滤液；在所得滤液中加入葡萄糖20g，加水至1000ml，自然pH，121℃灭菌20min，得PD液体培养基。

本发明还同时提供了一种抗菌活性物质的制备方法，依次包括如下步骤：

1)、取-70℃保存的Bacillus pumilus 223CCTCC NO：M2010075在PDA培养基上划线，35℃下培养24h；

2)、用接种环蘸取PDA平板上长出的单菌落，接入装有100ml SMA液体培养基的容器中，于35℃、200r/min培养30h；

3)、取100μl步骤2)所得的菌液均匀涂布于SMA固体培养基上，在超净工作台中吹干后，于35℃下倒置培养48h；

4)、用含质量浓度2％NaCl的50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)浸泡步骤3)的所得物，1h后将浸泡液离心，得上清液；

5)、按照每100ml上清液加入37～41克固体(NH₄)₂SO₄的比例，在上清液中加入(NH₄)₂SO₄，于0～4℃放置10～14小时，然后于12000r/min离心20min，所得沉淀用50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)重溶后，即为抗菌活性物质粗提液。

作为本发明的抗菌活性物质的制备方法的改进：