[发明专利]文蛤溶菌酶基因及其编码蛋白和应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学，具体的说是一种文蛤溶菌酶基因及其编码蛋白和应用。

背景技术

溶菌酶能够催化水解细菌细胞壁肽聚糖中N-乙酰葡聚糖和N-乙酰胞壁酸之间的β-1，4-糖苷键，从而导致细胞的裂解，达到杀菌的目的。已发现的溶菌酶分为不同的型，在动物中存在C型(鸡卵清溶菌酶)、G型(鹅卵清溶菌酶)和I型(无脊椎动物型)，其分布非常广泛。溶菌酶在生物体免疫防御体系中发挥作用，尤其对于缺少获得性免疫的贝类，在抵御外来细菌入侵时有着举足轻重的作用。另外，也有报道指出溶菌酶可以作为贝类的一种消化酶，通过分解滤食到的细菌，贝类可以得到自身所需的营养。

随着海水养殖行业的发展，养殖环境的污染、养殖病害频发等问题备受人们关注，传统的利用抗生素控制的办法受到了越来越多的质疑，而且也不适用于开放的海水养殖环境，开发新的有效的免疫增强剂就成为亟待解决的问题。来源于水产动物本身的溶菌酶作为一种天然无毒的酶制剂，为这一问题的解决带来了曙光，可以作为备选的新型免疫增强剂。由于人体细胞没有细胞壁成分，溶菌酶对人体没有毒副作用，对环境的压力也远小于抗生素。另外，溶菌酶作为一种天然的免疫增强剂、防腐剂、抗菌剂，已经广泛地被应用到食品、医药卫生和饲料行业中，例如奶粉添加剂、水产品保鲜防腐剂、饲料添加剂、去除原生质层，等等。其应用前景非常广泛。

文蛤是一种在沿海和滩涂地区广泛分布的双壳贝类(Wang et al.，1993)。在我国沿海，文蛤作为一种重要的经济贝类而被广泛养殖(Liu et al.，2006)。目前，还没有从文蛤中获得溶菌酶基因的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种文蛤溶菌酶基因及其编码蛋白和应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

文蛤I型溶菌酶基因，其是从文蛤中克隆得到的溶菌酶的cDNA序列，该序列全长552bp，其中完整阅读框441bp，5′非编码区15bp，3’非翻译区96bp，有多聚赖氨酸加尾信号(AATAA)和多聚赖氨酸尾巴。该基因在文蛤防御中发挥着重要作用，具体为序列表SEQ ID NO.1中碱基序列所示。所得溶菌酶基因利用pGEX-4T-1表达载体在大肠杆菌BL21中重组表达了该蛋白，表达产物具有抑菌活性。

其编码的蛋白具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，完整编码蛋白含有146个氨基酸，其中编码序列的1-15个氨基酸为信号肽序列，成熟肽包括131个氨基酸，其中含有14个半胱氨酸，预测分子量为14.6kDa。成熟肽具有典型的失稳酶超家族结构域(Destabilase superfamily)。

本发明利用构建cDNA文库，采用RACE技术以及体外重组表达技术，克隆到溶菌酶基因cDNA全长序列。通过PCR技术，扩增编码溶菌酶成熟肽的基因片断并将其克隆到pGEX-4T-1表达载体中，在大肠杆菌中重组表达了该蛋白。重组产物经过GSTrap FF亲和柱纯化以及凝血酶切掉GST融合蛋白后，获得了溶菌酶重组蛋白，经检测此重组蛋白具有较高的抑菌活性，能起到天然蛋白的功能，具有大规模生产的可能，可以弥补天然蛋白量低以致难以满足需要的局限。

附图说明

图1为本发明实施例纯化的文蛤溶菌酶重组蛋白，其中M：蛋白marker；1：带有GST标签的文蛤溶菌酶重组蛋白；2：用凝血酶切下的GST标签蛋白；3：切掉GST标签的文蛤溶菌酶重组蛋白。

图2为本发明实施例获得文蛤溶菌酶重组蛋白对藤黄微球菌(革兰氏阳性菌)的抑菌效果图。

图3为本发明实施例获得文蛤溶菌酶重组蛋白对铜绿假单胞菌(革兰氏阴性菌)的抑菌效果图。

具体实施方式

下面的实施例中将本发明作进一步阐述，但本发明不限于此。

实施例1.

一种克隆得到的文蛤溶菌酶基因，具有SEQ ID NO.1所示的序列。

本发明中的文蛤溶菌酶的cDNA序列克隆包括下列步骤：

a)文蛤总RNA的提取及mRNA的纯化；

b)文蛤cDNA文库构建；

c)文蛤cDNA文库EST序列的大规模测定；

d)文蛤EST序列的同源性分析及溶菌酶基因片段的筛选；

e)RACE扩增获得文蛤溶菌酶的全序列以及全序列的验证。

具体操作如下：

1.文蛤总RNA的提取及mRNA的纯化：利用Invitrogen公司的Trizol试剂从文蛤幼虫中提取总RNA，利用QIAGENE公司的OligotexmRNA纯化试剂盒纯化mRNA。