[发明专利]隐孢子虫CTL和Th混合多表位基因和融合蛋白及应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种隐孢子虫CTL和Th混合多表位基因和融合蛋白及其应用。

背景技术

隐孢子虫病(cryptosporidiosis)是由隐孢子虫(Cryptosporidiumspp.)引起的一种世界范围内广泛流行的人兽共患寄生虫病，可以感染包括人类在内的哺乳类、鸟类、爬行类、两栖类、鱼类等170多种动物。对免疫功能正常的宿主可引起自限性腹泻，对免疫功能受损的宿主则呈慢性腹泻并常常危及生命，给人类健康和生命安全带来了严重威胁，也给畜牧业生产造成了巨大的损失。隐孢子虫最先由Tyzzer于1907年在小鼠胃腺粘膜组织切片中发现。其中，微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)是最主要的人兽共患病病原。迄今为止，研究人员已在实验室筛选了上千种化学药物和抗生素，仍未找到理想的抗隐孢子虫药物。因此隐孢子虫病的免疫预防和治疗就显得十分重要，但目前仍缺乏有效的隐孢子虫病预防疫苗。

在以往的隐孢子虫疫苗研究中，人们通常在重组疫苗中编码一个全长的隐孢子虫抗原蛋白。但是，此类单一的疫苗候选分子的免疫保护效果并不理想，其原因可能是隐孢子虫基因组巨大，生活史复杂，抗原种类繁多，单一的抗原无法彻底阻断病原在宿主体内的生活周期，导致单一抗原、单一表位的免疫保护效果不够理想。考虑使用多抗原疫苗时，由于载体容量有限，并且大分子蛋白可能会造成动物免疫病理反应，所以在单一载体中加入多个抗原存在很大的局限性。近年来，国际寄生虫学界开始尝试利用抗原表位预测工具进行抗原表位预测，构建多表位疫苗(multi-epitope vaccine)，多表位疫苗也称鸡尾酒式疫苗，是同时携带多个与目标抗原相关的表位及辅助性表位的疫苗。与传统疫苗相比，多表位疫苗具有独特的优势，能被多种遗传背景的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)分子所识别、结合，从而得到高效的递呈，尤其在细胞免疫方面具有显著的优势，以应对病原微生物的变异以及免疫反应中诸多的不利因素。在抗疟疾多表位疫苗研制领域，已设计合成了多个基因工程疫苗和合成肽疫苗，取得了较好的免疫保护效果，其中不少已进入Ⅱ期或Ⅲ期临床试验。在隐孢子虫领域目前尚无这方面的报道。

为使机体获得最佳的免疫保护，构建多表位疫苗时需综合考虑机体的免疫应答特征和疾病的特殊性，针对性地选择目的抗原表位。体液免疫主要通过B细胞产生抗体来发挥作用，故可以选择特异性B细胞表位来定向诱导宿主的体液免疫应答。细胞免疫应答包括CD4⁺辅助性T细胞(helper T cell，Th细胞，分为Th1与Th2两个亚群)应答和CD8⁺细胞毒性T细胞(cytotoxicT lymphocyte，CTL)应答。因此，可根据机体对病原体的免疫应答特点，选择特异性的Th1、Th2或CTL表位来诱导机体免疫应答向Th1、Th2或CTL应答类型定向发展。

细胞免疫在宿主抗隐孢子虫感染过程中起着至关重要的作用。研究显示微小隐孢子虫初次和再次感染均引起强烈的细胞免疫反应，其中CD4⁺辅助性T细胞参与控制感染，CD8⁺细胞毒性T细胞则有很强的清除寄生虫的作用。

发明内容

本发明要解决缺少有效的隐孢子虫多表位疫苗的技术问题，提供一种隐孢子虫CTL和Th混合多表位基因和融合蛋白，该混合多表位基因和融合蛋白可用于制备抗隐孢子虫病的多表位疫苗。

此外，还需要提供一种隐孢子虫CTL和Th混合多表位基因和融合蛋白在制备预防或治疗隐孢子虫病的疫苗中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

在本发明的一个方面，提供了一种隐孢子虫混合多表位融合蛋白，包含：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3中任意一条或两条氨基酸序列。

所述SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3都富含CTL和Th表位，SEQ ID NO.1中含有4个CTL表位和2个Th表位，SEQ ID NO.3中含有3个CTL表位和1个Th表位。

优选的，所述隐孢子虫混合多表位融合蛋白还包含SEQ ID NO.2所示氨基酸序列，该序列中含有4个Th表位。增加SEQ ID NO.2序列可适当提高免疫肽分子量，以使免疫小鼠产生更高的血清抗体效价、具有更好免疫原性。