[发明专利]一种用于微生物采油过程优势菌群监测的方法

权利要求书

1.一种用于微生物采油过程优势菌群监测的方法，该方法包括下列步骤：

(1)、首先取油井采出液为样品，对样品中微生物的总DNA进行提取；

(2)、筛选合适的PCR-DGGE引物，通过对已知的用于PCR-DGGE的引物，进行筛选；

(3)、筛选引物的PCR扩增体系的优化；

(4)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)优化；

(5)、优势条带的胶回收测序；

(6)、优势条带的网络比对和分析。

2.根据权利要求1所述的用于微生物采油过程优势菌群监测的方法，其特征在于：总DNA的提取：①将1mL油井采出液振荡5min，然后3000r/min离心，留上清液；②加入2倍体积的10×PBS进行洗涤，振荡5min，然后12000r/min离心5min，去掉上清液；③加入10×PBS缓冲液100μL，然后超声40s；④用“DNA小量细菌提取试剂盒”，进行后续的DNA提取，然后保存在-20℃冰箱中；

3.根据权利要求1所述的用于微生物采油过程优势菌群监测的方法，其特征在于：筛选适合步骤(1)提取的DNA的PCR-DGGE引物，确定的引物为，DQF338：5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’；DQR534：5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’；

4.根据权利要求1所述的用于微生物采油过程优势菌群监测的方法，其特征在于：引物的PCR扩增体系：PCR反应体系(20μL)如下：10×buffer 2.0μL，2.0mmol/L dNTP 2μL，10pmol/L引物各1μL，Taq DNA酶0.3μL；PCR扩增条件为95℃预变性5min，94℃变性1min，52℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环，72℃延伸20min。

5.根据权利要求1所述的用于微生物采油过程优势菌群监测的方法，其特征在于：变性梯度凝胶电泳(DGGE)条件：①变性梯度胶的制备：使用梯度混合装置，制备6％(w/w)和8％(w/w)的聚丙烯酰胺凝胶，变性剂浓度从40％到60％，100％的变性剂为7mol/L的尿素和40％(w/w)的去离子甲酰胺的混合物，其中变性剂和丙烯酰胺的浓度从胶的上方向下方依次递增；②PCR样品的加样：待变性梯度胶完全聚合后，将胶板放入装有电泳缓冲液的电泳槽中，取PCR样品5μl和5μl的10×加样缓冲液混合后加入上样孔；③电泳及染色：引物扩增片断，在130V的电压下，60℃电泳7h；引物电泳结束后，将凝胶进行银染；④胶图扫描：将染色后的凝胶用UMAX PowerLook 1000透射扫描仪扫描后获取胶图。

6.根据权利要求1所述的用于微生物采油过程优势菌群监测的方法，其特征在于：优势条带的胶回收测序：用胶回收试剂盒切胶回收，后与pGEM-T载体连接，转化到大肠杆菌TOP10感受态细胞；LB固体培养基中加入氨苄青霉素Amp(5μg/mL)和X-gal，蓝白斑筛选转化子；提取质粒，用载体引物T7：5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’和SP6：5’-ATTTAG GTGACACTATAGAAT-3’检测；然后去测序。

7.根据权利要求1所述的用于微生物采油过程优势菌群监测的方法，其特征在于：优势条带的网络比对和分析：所测定的序列与GenBank数据库中的已知序列进行相似性比较分析，确定是否为采油菌种和优势菌种。