[发明专利]大豆过敏蛋白质基因Gly m Bd 30 K的RNAi植物表达载体

说明书

一、技术领域

本发明涉及了一个大豆过敏蛋白质基因Gly m Bd 30K的RNAi植物表达载体的构建，属于分子生物学和生物技术领域。

二、背景技术

RNA干扰(RNA interference，简称RNAi)，又称为转录后基因沉默，是一种快速关闭基因的新方法。也是研究生物体基因表达、调控与功能的一项新技术，其实质是小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)引起的生物细胞内同源基因的特异性沉默。其作用机理是siRNA与对应的mRNA特异结合并引起降解，从而阻止mRNA的翻译，特异性抑制靶基因的表达，因此成为基因敲除(gene knockout)的强大工具。目前，随着研究的不断深入，RNAi的机制正被逐步阐明，同时作为功能基因组研究领域中的有力工具，RNAi也越来越为人们所重视。

大豆[Glycine max(L.)Merr.]食物过敏是一个全世界密切关注的公共健康问题。大豆蛋白在食品加工业的广泛应用，给大豆过敏人群带来了一定的食物安全问题。调查发现，全世界约2％的成年人和6％～8％的儿童患有食物过敏症，大豆过敏症多发于5岁以下的幼儿，主要表现为胃部不适或过敏性皮炎，主要的症状是口周红斑、唇肿、起疹子、皮肤发痒、腹泻等，严重时可危及生命。如何降低大豆过敏原含量，保证大豆食品安全，已经成为一个世界范围内的重大课题。

最安全有效防止大豆食品过敏的措施就是培育脱致敏的大豆新品种。尽管传统育种技术已经成功地改善了大豆的营养价值，然而，这种过程不仅耗时，而且利用空间有限，也很难同时改变大豆多个品质性状，毕竟，大豆可改良的遗传资源是有限的，并且对于大豆性状的改良只限于已经得到的突变体材料。而RNA干扰技术，能够扩大可操作基因的范围和突变的种类，且对目的基因的表达有了可控性，同时RNAi所具有的特异性、稳定性、高效、快速以及不改变其它基因的表达等特性，为RNAi在植物功能基因组学研究以及植物的遗传改良等方面提供了一个强有力的手段。RNAi技术在作物品质改良上具有广阔的应用前景。

三、发明内容

技术问题：本发明涉及大豆过敏蛋白质基因Gly m Bd 30K的RNAi植物表达载体的构建，属于分子生物学领域。构建的RNAi植物表达载体可导入大豆及其它含有过敏蛋白质的植物，消除过敏蛋白质对过敏人群的危害，可用于植物品种改良。

技术方案：

1)Gly m Bd 30K干扰片段的克隆：

选用‘南农32’作为材料，取幼嫩籽粒，按照TakaRa公司的Total RNA提取试剂盒说明书提取豆粒总RNA，取2μg总RNA合成cDNA，用RNase消化cDNA产物。设计引物扩增Gly m Bd 30K干扰片段：

Ps：CCTTGTGTTGCTTCTTTTCTCC，

Pa：GATGGTCACAAGAATATTGTTC，

Gly m Bd 30K干扰片段长395bp，进行常规聚合酶链式(PCR)反应，以提取的cDNA为模板，扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30sec，51.8℃复性30sec，72℃延伸1min，30个循环后，72℃总延伸10min，将PCR产物连接到pMD19-T载体上，转化TOP10细胞，进行序列测定后续实验中备用。

2)内含子片段的克隆：

设计引物扩增内含子片段：

Is：GTAAATTTCTAGTTTTTCTCCT，

Ia：CTGTAACTATCATCATCATCAT，

内含子片段长190bp，进行常规PCR反应，pCAMBIA1301质粒为模板，扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30sec，45.3℃复性30sec，72℃延伸1min，30个循环后，72℃总延伸10min，将PCR产物连接到pMD19-T载体上，转化TOP10细胞，进行序列测定后续实验中备用。

3)Gly m Bd 30K干扰载体的构建：

通过融合PCR的方法将三个片段[30k-antisense(A)、intron(I)和30k-sense(S)]连接起来。设计四条引物，P1、P2、P3、P4，在两端引入酶切位点BstE II和PmI I。

引物序列：

P1：acCACGTGGATGGTCACAAGAATATTGTTCCTTC

P2：ACTAGAAATTTACCCTTGTGTTG(P2各有A和I的一部分)