[发明专利]一种通过游离小孢子培养获得鸭茅单倍体植株的方法

权利要求书

1.一种获得鸭茅单倍体植株的方法，包括如下步骤：组织培养鸭茅的小孢子，得到鸭茅单倍体植株。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述小孢子为处于如下发育时期的小孢子：小孢子的细胞核处于单核中期或单核晚期。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述组织培养的方法包括如下步骤：1)培养所述小孢子，得到胚状体；2)培养所述胚状体，得到鸭茅单倍体植株。

4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，培养的条件为：温度为20℃-30℃、黑暗和培养时间为20天-30天；所述温度具体为20℃、25℃、30℃；所述培养时间为20天、25天、30天。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述小孢子的初始密度为10,000个/ml培养基-500,000个/ml培养基，具体为10,000个/ml培养基、100,000个/ml培养基、500,000个/ml培养基。

6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，培养的条件为：温度为20℃-30℃，光照时间为5小时/天-11小时/天，光照强度为20μmol/m²·s-80μmol/m²·s；所述温度具体为20℃、25℃或30℃；所述光照时间具体为5小时/天、8小时/天或11小时/天；所述光照强度具体为20μmol/m²·s、50μmol/m²·s或80μmol/m²·s。

7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所述胚状体的长度为1mm-2mm。

8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：所述方法中，在所述步骤1)后，步骤2)前，包括如下步骤：将步骤1)中得到的小于1mm长的胚状体继代培养至胚状体长度为1mm-2mm；所述继代培养的条件为：温度为20℃-30℃和黑暗；所述温度具体为20℃、25℃或30℃。

9.根据权利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中使用的培养基的组成为：由NH₄NO₃、KNO₃、KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O、CaCl₂·2H₂O、MnSO₄·5H₂O、ZnSO₄·7H₂O、H₃BO₃、Na₂MoO₄·2H₂O、CuSO₄·5H₂O、CoCl₂·6H₂O、Fe-Na₂·EDTA、谷氨酸、肌醇、维生素B1、麦芽糖、植物凝胶和水组成；NH₄NO₃在培养基中的浓度为165mg/L，KNO₃在培养基中的浓度为1900mg/L，KH₂PO₄在培养基中的浓度为170mg/L，MgSO₄·7H₂O在培养基中的浓度为370mg/L，CaCl₂·2H₂O在培养基中的浓度为440mg/L，MnSO₄·5H₂O在培养基中的浓度为22.3mg/L，ZnSO₄·7H₂O在培养基中的浓度为8.6mg/L，H₃BO₃在培养基中的浓度为6.2mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O在培养基中的浓度为0.25mg/L，CuSO₄·5H₂O在培养基中的浓度为0.025mg/L，CoCl₂·6H₂O在培养基中的浓度为0.025mg/L，Fe-Na₂·EDTA在培养基中的浓度为40mg/L，谷氨酸在培养基中的浓度为750mg/L，肌醇在培养基中的浓度为100mg/L，维生素B1在培养基中的浓度为0.4mg/L，麦芽糖在培养基中的浓度为62,000mg/L，植物凝胶在培养基中的浓度为3000mg/L；

所述步骤2)中使用的培养基的组成为：由NH₄NO₃、KNO₃、KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O、CaCl₂·2H₂O、MnSO₄·4H₂O、ZnSO₄·7H₂O、H₃BO₃、KI、Na₂MoO₄·2H₂O、CuSO₄·5H₂O、CoCl₂·6H₂O、Na₂EDTA、FeSO₄·7H₂O、甘氨酸、蔗糖、琼脂和水组成；NH₄NO₃在培养基中的浓度为1650mg/L，KNO₃在培养基中的浓度为1900mg/L，KH₂PO₄在培养基中的浓度为170mg/L，MgSO₄·7H₂O在培养基中的浓度为370mg/L，CaCl₂·2H₂O在培养基中的浓度为440mg/L，MnSO₄·4H₂O在培养基中的浓度为22.3mg/L，ZnSO₄·7H₂O在培养基中的浓度为8.6mg/L，H₃BO₃在培养基中的浓度为6.2mg/L，KI在培养基中的浓度为0.83mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O在培养基中的浓度为0.25mg/L，CuSO₄·5H₂O在培养基中的浓度为0.025mg/L，CoCl₂·6H₂O在培养基中的浓度为0.025mg/L，Na₂EDTA在培养基中的浓度为37.25mg/L，FeSO₄·7H₂O在培养基中的浓度为27.85mg/L，甘氨酸在培养基中的浓度为2mg/L，蔗糖在培养基中的浓度为30,000mg/L，琼脂在培养基中的浓度为8000mg/L。

10.根据权利要求1-9中任一所述的方法，其特征在于：所述方法中，在所述组织培养前，包括如下分离所述小孢子的步骤：用有效氯质量百分含量为3％的次氯酸钠水溶液将鸭茅穗表面消毒10-15min，得到消毒后的鸭茅穗；将所述消毒后的鸭茅穗用0.3M甘露醇水溶液在4℃条件下浸泡3-5天，得到预处理后的鸭茅穗；将预处理后的鸭茅穗剪成2-3厘米小段，然后在600r/min转速下粉碎5-10秒，得到粉碎混合物；将所述粉碎混合物经100μm孔径过滤，收集滤液，将滤液50g离心5min，收集沉淀，即得到小孢子。