[发明专利]一种新型神经营养因子及其制备与应用

说明书

技术领域：

本发明涉及一种新型神经营养因子的克隆、制备与应用，涉及遗传工程领域，属于生物技术领域。

背景技术：

神经生长因子(nerve growth factor，NGF)是主要作用于外周神经系统的感觉和交感神经元的蛋白质，通过细胞表面特异受体支持靶神经元的生存、促进神经突起的生长和增强神经元的分化。NGF的作用导致神经元细胞膜结构、蛋白磷酸化状态和特定基因表达水平的改变。前脑胆碱能神经元也是NGF的靶细胞，并且NGF的营养支持作用是必须的。NGF及其受体在中枢神经系统的分布和发育学特点表明，NGF是基底前脑胆碱能神经元的靶源性神经营养因子。

继NGF被发现之后，又有许多神经营养因子被鉴定出来，包括脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、睫状神经营养因子(ciliarneurotrophic factor，CNTF)、胶质源性神经营养因子(glial cell-derived neurotrophicfactor，GDNF)等。除了营养支持作用，近些年对神经营养因子功能研究的突破在于，神经营养因子可以调控神经突触可塑性，参与学习和记忆的形成。

神经营养因子改变参与大量神经系统疾病的发生发展。神经营养因子已经广泛用于神经系统疾病模型的治疗，效果明确。相关临床实验也在进行之中，BDNF用于治疗脊髓侧索硬化症的三期临床实验表明高剂量有疗效。NGF用于阿尔茨海默病的治疗已经通过临床二期实验。GDNF用于治疗帕金森病的临床二期实验效果明显，但临床三期实验效果不明显，可能跟整个治疗环节不够完善有关系。

发明内容：

本发明的目的在于鉴定一种新型神经营养因子，获得其编码核苷酸序列，通过培养细胞重组表达获得该因子，制备该因子的抗体，提供利用该基因和蛋白进行疾病诊断、预防保健和治疗的方法。

本发明首次提供一种新型神经营养因子的核苷酸序列，该序列包含完整编码区，该神经营养因子主要由神经元细胞合成并分泌，因此命名为神经元衍生的神经营养因子(neuron-derived neurotrophic factor，NDNF)。一方面，获得的编码完整NDNF的核苷酸片段保存于载体上；同时，含有NDNF编码区的载体转染培养细胞，从培养基上清中获得NDNF蛋白。获得的NDNF蛋白作用于原代培养神经元，结果表明NDNF蛋白可以促进神经元迁移和分化成熟，因此可以用于神经系统疾病的预防保健、诊断和治疗。

本发明的目的是这样实现的：从正常人脑组织中提取总RNA，进行反转录合成cDNA一链，以之为模板，采用引物进行PCR扩增；扩增出的特异片段电泳回收，使用XhoI和HindIII限制性内切酶进行酶切，然后克隆到pcDNA3.1(-)/myc-His A质粒载体上，进行序列测定，测序得到的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列(见序列表)，该序列编码的蛋白质含有568个氨基酸残基，分子量为64.7kD；经与相关数据库检索对照发现，未发现与所示序列相同的已知功能的序列，证明本发明得到的蛋白质属于功能未知的新蛋白质。功能实验研究表明该蛋白质可以促进神经元迁移和分化成熟，属于神经营养因子。结构分析表明，该蛋白含有III型纤连蛋白结构域，与经典的NGF家族神经营养因子结构不同。同时，组织分布和细胞分布实验研究表明，该蛋白主要在神经系统的神经元表达。综上结果，我们将其命名为神经元衍生的神经营养因子(neuron-derived neurotrophic factor，NDNF)。

另外，由于专业人士常使用COS7(非洲绿猴肾细胞系)制备基因重组蛋白质，因而本发明采用COS7细胞制备神经营养因子NDNF。具体过程为：COS7细胞采用DMEM培养基、10％胎牛血清、37℃和5％二氧化碳条件下培养。转染前一天细胞铺六孔板，转染当天大约50％-60％的汇合度，转染前4小时，换新鲜培养液(不含血清和抗生素)。配制转染溶液加入，孵箱孵育2-3小时后，换上含血清和抗生素的培养液，48小时后收集培养基上清，采用蛋白免疫印迹法鉴定上清中含有的NDNF蛋白，该上清用于Transwell实验，验证NDNF是否具有促进神经元迁移和分化成熟功能。