[发明专利]利用EST-SSR标记构建棉花纤维转录遗传连锁图谱的方法

说明书

技术领域

本发明属于棉花分子育种技术领域。具体涉及利用EST-SSR标记构建棉花纤维转录遗传连锁图谱方法。

背景技术

分子遗传连锁图已经在多种植物中构建。棉花分子标记连锁图的构建始于1994年。自1994年Reinish应用限制性片段长度多态性(RFLP)标记构建了一张包含705个多态性位点，总长4675cM的棉花遗传连锁图后，许多研究者(Rong，J.，C.Abbey，et al，2004；Nguyen，T.，M.Giband，et al，2004；He，D.，Z.Lin，et al，2007；Guo，W.，C.Cai，et al，2007；Zhang，Y.，Z.Lin，et al，2008)也利用不同标记方法构建了多张棉花的遗传连锁图。

但是以往的标记都是在DNA水平上进行的，有其局限性：首先，以往的遗传连锁图采用随机分布的标记，定位纤维性状的QTL，不同研究者获得结果几乎没有吻合性；其次，生物的RNA信息含量远远大于其DNA的信息含量，在DNA水平上无法研究“被压缩”的那部分遗传信息。所以，在cDNA水平上构建棉花纤维的转录图谱，在纤维cDNA水平上进行的纤维品质的QTL研究，将会增加QTL的真实性和实用性，更好更快地帮助育种家找到控制目标性状的基因，为分子标记辅助育种奠定基础。

目前构建转录图谱多采用cDNA-AFLP的策略。付凤玲等(2003)介绍了利用cDNA-AFLP技术构建基因组转录图谱的大致过程；范淑英等(2008)利用cDNA-AFLP技术构建了一个包括164个标记，由13个连锁群组成，图谱总长度为1401.2cM的分子转录图谱；Ritter等(2008)利用cDNA-AFLP构建马铃薯的转录图谱，该图含有700个TDFs，全长800cM。另外，在棉花研究中，潘玉欣等(2007)利用cDNA-AFLP技术对棉花纤维发育次生壁加厚期(20-25天)基因的表达谱进行分析，构建了棉花纤维次生壁加厚期的转录图谱。

但是，采用cDNA-AFLP策略构建转录图谱有很多不足之处：首先，AFLP操作过程繁琐，需要酶切和需要两次扩增；其次，对cDNA质量要求很高，而有些作物(例如棉花)的RNA提取复杂，质量不高，反转录所得到的双链cDNA难以达到酶切的质量和浓度；三是费用高，不适合对群体分析作图。

已报道的构建转录图谱的另一种方法是cDNA-SRAP。cDNA-SRAP相比cDNA-AFLP有一定优势：第一，cDNA-SRAP对cDNA直接扩增，无需酶切、连接等一系列的步骤；其次，该标记对cDNA质量的要求不是很严格，对于棉花这类不易得到高质量RNA的植物而言非常适合；三是只需要用cDNA第一链即可，无需进行第二链的合成，既简化了步骤又节约了成本；四是多数的SRAP标记包含了编码框中的外显子，为基因的分离克隆提供了极大方便。Li等(2003)已经用花椰菜DH支柱和青菜花杂交的F₂群体为作图群体，利用cDNA-SRAP标记构建了含有247个标记的转录图谱。

然而，利用cDNA-SRAP标记构建转录图谱并不是最简便的途径，并且其条带不够丰富、稳定性不高。随着ESTs数据库的不断发展壮大，大量增加的ESTs为EST-SSR的开发提供了充足丰富的资源，而且SSR标记具有操作简便、成功率高、无假阳性、共显性等优点，因此EST-SSR是构建转录图谱更为理想的方法。目前还没有利用EST-SSR构建转录图谱的报道。