[发明专利]GM-CSF/TNF-α膜表面修饰的前列腺癌治疗性疫苗

说明书

技术领域

本发明属基因工程和细胞工程应用领域，GM-CSF/TNF-α膜表面修饰的前列腺癌治疗性疫苗，其特征在于链亲合素标记的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(SA-GM-CSF)双功能融合蛋白和肿瘤坏死因子α(SA-TNFα)双功能融合蛋白同时修饰锚定在已生物素化且灭活的前列腺癌细胞表面，并且这些锚定在前列腺癌细胞表面的GM-CSF和TNF-α仍然能保持相应的生物活性。

背景技术

当前，前列腺癌的发病率在不断升高，已成为危害我国老年男性健康的最常见恶性肿瘤之一。前列腺癌常常容易发展为雄激素非依赖，而目前对此类前列腺癌尚无有效的治疗方法。

GM-CSF基因修饰的前列腺癌细胞治疗性疫苗对晚期激素非依赖的转移性前列腺癌Ⅱ期临床试验显示：接受疫苗组的病人中位生存期为35.2个月，而常规紫杉醇化疗组的病人中位生存期仅为18个月。该疫苗是用腺病毒作载体将GM-CSF基因导入前列腺癌细胞株PC-3(对雄激素不敏感)和LNCaP(对雄激素敏感)肿瘤细胞内，筛选出能高效分泌GM-CSF的肿瘤细胞克隆、γ-射线灭活后制成的前列腺癌治疗性疫苗。

但是，用基因修饰法制备肿瘤细胞疫苗存在如下固有缺陷：修饰效率一般都较低，并取决于肿瘤细胞的类型；肿瘤细胞疫苗接种到机体后，因经γ-射线灭活作用瘤苗细胞已进入凋零程序，从而导致导入基因的表达效率较低，致使表达产物的有效浓度在局部常常不能达到且不能较长时间地维持，从而实际抗肿瘤的临床效果有限；往往有潜在的病毒载体安全性问题和免疫原性问题(反复使用同一病毒载体会影响导入基因的表达效率)；很难同时高效表达多个具有协同作用的免疫刺激因子(如GM-CSF和TNFα)，不能对它们的表达量进行有效控制。此外，制备基因修饰的自体肿瘤细胞疫苗比较费时，成本较高，不易大规模开展。

为了克服目前基因修饰法制备肿瘤细胞疫苗存在的诸多固有缺陷，我们建立了一种快速、高效、安全的细胞膜表面锚定修饰技术。这个技术平台的基本原理是充分利用了细胞膜表面蛋白质的氨基(即-NH2)易生物素化以及生物素与链亲和素高效而强有力、几乎不可逆的结合——这两个特性。该技术有二个步骤：先用生物素化试剂将生物素交联到欲修饰的肿瘤细胞表面，然后链亲和素标记的免疫刺激因子(如细胞因子或/和免疫共刺激分子等)双功能融合蛋白借助链亲和素与生物素的特异结合将免疫刺激因子锚定在肿瘤细胞表面。利用该技术平台，可在体外对肿瘤细胞进行快速表面锚定修饰(4小时内完成)，使多种具有免疫协同作用的免疫刺激因子共同迅速永久地锚定修饰在肿瘤细胞的表面，且锚定修饰的量可进行精确控制。

因此，本发明将制备的SA-GM-CSF和SA-TNFα双功能融合蛋白、同时修饰锚定在已生物素化且酒精灭活的前列腺癌细胞表面，制备成新型的前列腺癌治疗性疫苗。

发明内容

GM-CSF/TNF-α膜表面修饰的前列腺癌治疗性疫苗的发明过程如下：

首先制备SA-GM-CSF和SA-TNFα双功能融合蛋白(参见发明专利2004100525364)；用30％酒精灭活肿瘤细胞，因该处理能使细胞的形态不改变和细胞膜保持完整；用生物素化试剂将生物素化学交联到酒精灭活的肿瘤细胞表面；最后，将SA-GM-CSF和SA-TNFα这两个双功能融合蛋白持久锚定在生物素化的肿瘤细胞表面，制备成前列腺癌治疗性疫苗。

附图说明

图1.不同浓度酒精处理的肿瘤细胞免疫原性。

图2.GM-CSF和TNF-α同时锚定在酒精灭活且已生物素化的RM-1前列腺癌细胞表面。

图3.锚定在生物素化的RM-1前列腺癌细胞表面的SA-GM-CSF之GM-CSF生物活性测定。

图4.锚定在生物素化的RM-1前列腺癌细胞表面的SA-TNFα之TNF-α生物活性测定。

图5.GM-CSF/TNF-α膜表面修饰RM-1前列腺癌细胞疫苗免疫原性的检测，观察肿瘤的发生率(A图)、肿瘤体积(B图)、小鼠的生存时间(C图)。

图6.GM-CSF/TNF-α膜表面修饰RM-1前列腺癌疫苗对小鼠正位前列腺癌模型的疗效(生存曲线)。

图7.GM-CSF/TNF-α膜表面修饰RM-1前列腺癌疫苗治疗正位前列腺癌模型后第1周，取小鼠脾行细胞毒性试验，比较各组裂解前列腺癌靶细胞的能力。

图8.脾细胞、IL-2和丝裂霉素处理过的肿瘤细胞三者共同孵育5天，各组上清含有IFN-γ、IL-4的定量分析及比较。

图9.治疗后脾细胞流式分析。

图10.免疫组化分析治疗后肿瘤组织CD4和CD8T淋巴细胞的浸润情况。

具体实施方式