[发明专利]一种中华甲虫蒲螨毒素蛋白及其基因

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域，特别是涉及一种中华甲虫蒲螨毒素蛋白及其基因。 

背景技术

小蠹虫、长蠹、吉丁虫(鞘翅目)；红铃虫、米蛾(鳞翅目)；红蚁(膜翅目)等是一类隐蔽在树皮下危害树木的害虫，化学防治很难奏效。以小蠹虫为例，小蠹虫被称为森林的“头号杀手”，虫害严重的地区每年用于小蠹虫的防治费用是230元/亩，常规防治也要40元/亩，但仍然不能遏止每年数百万立方米林木材积的损失，据专家估计，其造成的经济损失约占全部虫害损失的一半。郁郁葱葱的森林在冥冥中变成了毫无生机的死地。因此多年来国内外许多学者孜孜不倦地寻找高效的生物作用物，以控制此类害虫。 

蒲螨(Pyemotes)为昆虫外寄生螨，体长仅200μm左右，其寄主主要是上述隐蔽性害虫，蒲螨控制寄主的能力极强，含有对寄主昆虫高毒而对哺乳动物安全的神经毒素，1只蒲螨可制服比其体重大166000倍的寄主。由此可见，这是一类有广阔应用前景的天敌资源。 

国外有关研究起步较早，1850年Newport在谷物、棉花上发现了一种球腹蒲螨，50年代末以后，发达国家对有关资源做了持续、系统的调查，发表18种蒲螨，至今方兴未艾。80年代年美国学者Tomalski、Bruce等开始系统研究美国重要蒲螨麦蒲螨(P.tritici)，得到了该蒲螨的毒素基因Tox34和Tox21，1991年将Tox34转移到苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒中，得到表达。但麦蒲螨则主要以鳞翅目和膜翅目为主要寄主，例如，麦蒲螨人工释放用于防治印度谷螟(Plodia interpunctella(Hübner))，至今未见到释放麦蒲螨控制鞘翅目害虫的报道。 

1990年本发明人在小蠹虫体上发现了我国第一种蒲螨，此后对我国的蒲螨资源做了较系统的调查，在多种钻蛀性甲虫上发现了1种高寄生率的蒲螨，经系统研究，明确其为我国特有的优势蒲螨种，定名为中华甲虫蒲螨(Pyemotes zhonghuajia)，它含有对昆虫高毒的蒲螨毒素，特别的，它是鞘翅目害虫的强力控制因子。 

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种中华甲虫蒲螨毒素蛋白及其编码基因，或与SEQ ID NO：1所示核苷酸编码相同蛋白的核苷酸序列。 

本发明的第二个目的在于提供制备上述蒲螨毒素蛋白的方法。 

本发明的第三个目的在于提供上述蒲螨毒素蛋白及其编码基因的应用。 

本发明从中华甲虫蒲螨中分离纯化得到中华甲虫蒲螨毒素蛋白，其N-氨基酸序列为N-Asp-Asn-Gly-Asn-Val-Glu-Ser-Val-Arg-Ala-。为便于表述，现将该蛋白命名为Ptg1-1。 

PTG1-1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该基因全长649bp。 

应当理解，在不影响PTG1-1蛋白活性的前提下(不在蛋白的活性中心)，本领域技术人员可对SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有同等功能的氨基酸序列。 

此外，考虑到密码子的简并性，例如可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，或在其非编码区在不影响蛋白表达的条件下，对编码上述蛋白的基因序列进行修改。因此，本发明还包含对编码上述蛋白的基因序列进行的替换、添加和/或缺失一个或多个核苷酸，具有与上述编码基因具有相同功能的核苷酸序列。本发明还包括基于所述基因的正义序列或反义序列，包括含有所述核苷酸序列或其片段的 克隆载体或表达载体、含有所述载体的宿主细胞，利用所述宿主细胞制备蒲螨毒素蛋白的方法等等。 

本发明所述的中华甲虫蒲螨毒素蛋白可用于杀灭害虫，制备生物杀虫剂；所述基因可用于提高植物抗虫活性、制备转基因植物。 

本发明的中华甲虫蒲螨毒素蛋白的提取、浓缩和纯化过程如下： 

1、预处理：将进入产后代高峰期时的中华甲虫蒲螨进行液氮速冻，-40℃保存备用，取适量冷冻样品加入醋酸缓冲液研磨，离心分离，收集上清液； 

2、粗分离：将上清液用沉淀法或冷冻干燥法浓缩； 

3、纯化：采用常规的层析法进行，所述层析法包括离子交换层析、凝胶过滤、吸附层析以及亲和层析等的离子交换层析； 

4、测序：电泳分离具有生物活性的毒素蛋白，应用电转移方法将胶中的蛋白转到PVDF膜上，应用Edman降解法测定毒素蛋白N-末端的10个氨基酸的序列。