[发明专利]猴泡沫病毒重组抗原ELISA检测方法及试剂盒

权利要求书

1.一种猴泡沫病毒的重组抗原ELISA检测方法，是用SFV Gag蛋白C端的前193个氨基酸构成的表位包被酶联板，用常规ELISA方法对待测样品进行检测。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述检测方法包括以下步骤：

1)用SFV Gag蛋白C端的前193个氨基酸构成的表位作为包被抗体包被酶联板，洗板；

2)加待测样品或已知浓度的标准品一SFV抗血清，洗板；

3)加酶标二抗，洗板；

4)加底物显色；

5)终止反应；

6)测定A492值；

7)分析结果，得到SFV抗体水平。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：步骤1)中SFV Gag蛋白C端的前193个氨基酸构成的表位的包被浓度为5μg/mL；步骤2)中的待测样品血清的稀释度为1∶80；标准品的浓度梯度为10ng/mL、1ng/mL、10^-1ng/mL、10^-2ng/mL、10^-3ng/mL、10^-4ng/mL、10^-5ng/mL、10^-6ng/mL；步骤3)中的二抗为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶标记的羊抗人抗抗体，酶标二抗的稀释度优选为1∶30000；步骤1)-3)中的洗涤液均为含0.1％吐温的1×PBS；步骤7)中的结果分析方法为：先根据标准品的浓度和A492值，利用CurveExpert软件获得一个最佳的曲线方程，并得到一条标准曲线，横坐标为标准品浓度，纵坐标为A492值；再将样品和对照孔的A492值代入曲线方程，并乘以相应的稀释倍数，得到样品和对照孔的相应浓度，即SFV抗体水平，其中样品的A492值取复孔的平均值。

4.根据权利要求1或2或3所述的检测方法，其特征在于：SFV Gag蛋白C端的前193个氨基酸构成的表位为经原核表达的重组蛋白，具体方法为：将SFV Gag蛋白C端的前193个氨基酸的编码序列插入大肠杆菌表达载体中，再将构建的重组表达载体导入大肠杆菌，经表达、纯化得到高活性的目的蛋白；所述SFV Gag蛋白C端的前193个氨基酸的编码序列具有序列表中序列1的核苷酸序列。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：

所述SFV Gag蛋白C端的前193个氨基酸的编码序列的5’端和3’端还连接有Kpn I和Sac I识别位点；所述连接有Kpn I和Sac I识别位点的SFV Gag蛋白C端的前193个氨基酸的编码序列具有序列表中序列2的核苷酸序列；

所述宿主菌大肠杆菌具体为BL21(DH3)、BL21(DE3，plysS)，E.coli JM109，E.coli HB101或E.coli Top10，优选为BL21(DH3)；

用于构建所述重组表达载体的出发载体可为现有的在上述大肠杆菌中表达外源基因的表达载体；其中，以pET30a(+)为出发载体，构建的携带有SFV Gag蛋白C端的前193个氨基酸的编码序列的重组表达载体为pET30a(+)-Gag193。

转化有pET30a(+)-Gag193的重组大肠杆菌为pET30a(+)-Gag193/大肠杆菌BL21(DE3)。

6.根据权利要求4或5所述的检测方法，其特征在于：其中，发酵工程菌时需加入IPTG诱导剂，所加入IPTG的浓度为1.0-2.0mM，优选为1.5mM，诱导温度为35-39℃，优选为37℃，诱导时间为1-5小时，优选为3小时。

7.根据权利要求4或5或6所述的检测方法，其特征在于：所述目的蛋白的纯化方法，包括以下步骤：

1)将菌体重悬于PBS中，离心，上清用脱盐柱处理；

2)将经脱盐柱处理后的流出液用Ni离子亲和层析法纯化目的蛋白。

8.一种猴泡沫病毒的重组抗原ELISA检测试剂盒，包括SFV Gag蛋白C端的前193个氨基酸构成的表位。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括第二抗体，即辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶标记的羊抗人抗抗体。

10.根据权利要求8或9所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括检测用的洗涤液，为含0.1％吐温的1×PBS、0.01M PB液、Tween-20和PBST中的一种或几种；抗体稀释液，为0.01M Tris·HCl缓冲液(pH 8.9)或50mM碳酸盐缓冲液(pH 9.5)；样品稀释液，为含0.5％BSA的PBS液；显色液，为含0.02％H₂O₂的0.1mol/L柠檬酸、3’，3’，5’，5’-四甲基联苯胺或邻苯二胺溶液；终止反应液，为2M 98％H₂SO₄；检测板，为ELISA板。