[发明专利]一种东北虎肠道益生菌群的制备方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种东北虎肠道益生菌群的制备方法，属生物工程领域。

(二)背景技术

近几十年来，由于人类活动对环境的造成栖息地破碎化和食物短缺，以及人类的非法盗猎、扑杀和贸易造成野生东北虎生种群数量急剧下降，东北虎已被列入中国I级保护动物并被列入濒危野生动植物种。目前在我国各种类型的动物园有120多家其中约有40多家有东北虎。尤其是以黑龙江东北虎林园、广西桂林雄森熊虎山庄等代表的大型猫科动物繁殖基地为东北虎动物种群的扩大作出了巨大贡献，已有的圈养东北虎种群将成为野生种群扩大发展的重要后备力量。

但随着东北虎种群数量的增加和饲养密度的加大，一些危害严重的传染病发生的机会也随之增加。尤其是东北虎幼仔，抵抗力较差，常发生大肠杆菌、魏氏梭菌、细小病毒感染等消化道疾病，极大地降低了幼虎的成活率。我们研究认为，正常条件下，幼龄东北虎肠道内一般都存在正常菌群。菌群之间靠相互制约来维持相对平衡，正常菌群中的细菌一般对虎不致病，相反，有些细菌对虎体具有益生的生理作用。例如双歧杆菌菌体代谢产生多种维生素，可促进虎体的生长发育。然而，由于幼虎的抵抗力较差，各种应急反应和大量使用抗生素治疗疾病时，都极易导致肠道内的正常菌群失调，导致一些消化道传染病的发生。应用了微生态制剂后，逐步恢复了肠道内正常菌群，改善了胃肠功能，提高了食物消化率，抑制了肠道腐败菌生长、增强了机体免疫力。

本发明采用5株肠道益生菌为出发菌株，经过体外包埋后制成微生态菌剂，添加于饲料中东北虎幼崽，1年多来的反馈情况表明，饲喂后幼虎的消化道疾病发生明显减少，幼虎的成活率明显提高。

(三)发明内容

本发明目的在于提供一种东北虎肠道益生菌群的制备方法。

本发明的目的是这样实现的：本发明中所涉及的百分比除另有注明之外为质量比，本发明的产品采用这样的方法来制备的：

1.益生菌的选择及培养基的制备

A菌——嗜酸乳杆菌CICC6074(Lactobacillus acidophilus)，培养基为：蛋白胨10克，牛肉膏10克，酵母浸膏5克，葡萄糖20克，磷酸氢二钾2克，醋酸钠5克，柠檬酸铵2克，硫酸镁0.2克，硫酸锰0.2克，吐温801毫升，水1000毫升，pH6.2-6.6。

B菌——植物乳杆菌CICC6002(Lactobacillus plantarum)5°Bé麦芽汁中加入酵母膏0.5，无菌碳酸钙0.6。

C菌——乳酸乳球菌CICC23610(Lactobacillus lactis)蛋白胨10克，牛肉膏10克，酵母浸膏5克，葡萄糖20克，磷酸氢二钾2克，醋酸钠5克，柠檬酸铵2克，硫酸镁0.2克，硫酸锰0.2克，吐温801毫升，水1000毫升，琼脂1.5～2.0％，pH6.2-6.6。

D菌——鼠李糖乳杆菌CICC6001(Lactobacillus rhamnosus)5°Bé麦芽汁中加入酵母膏0.5，无菌碳酸钙0.6。

E菌——两歧双歧杆菌CICC6168(Bifidobacterium bifidum)

酪蛋白胨10g，肉汤提取物5g，酵母提取物5g，大豆蛋白胨5g，葡萄糖10g，吐温801ml，K₂HPO₄ 2g/L，MgSO₄×7H₂O 0.2g/L，MnSO₄x H₂O 0.05g/L，NaCl 5g，盐溶液4ml，刃天青(25mg/100ml)4ml，蒸馏水950ml，培养基煮至沸腾，添加半胱氨酸，调pH至6.8后，在CO₂下冷却。盐溶液：CaCl₂×2H₂O 0.25g/L，KH₂PO₄ 1g/L，K₂HPO₄ 1g/L，MgSO₄×7H₂O 0.5g/L，NaHCO₃ 10g/L，NaCl 2g/L

2.益生菌群的制备过程

2.1冻干菌粉末的活化

分别量取0.9％的生理盐水10ml于5只试管内，经121℃灭菌20分钟冷却至30℃，将5株乳酸菌安瓶内的冻干菌粉末在无菌状态下全部倒入0.9％的生理盐水中，震荡使其溶解，在30℃恒温箱中静止活化30分钟，备用。

2.2益生菌扩大培养

2.2.1母发酵剂的制备