[发明专利]一种生物柴油脂肪复合酶的制备方法

说明书

一、技术领域

本发明提供了一种新的脂肪酶复合酶的制备方法，涉及微生物发酵、复配工艺生产脂肪酶复合酶。 

二、技术背景

脂肪复合酶指的是分解油脂生成脂肪酸、甘油、多不饱和脂肪酸等的一类酶的总称，它不是单种酶，而是起协同作用的多组分酶系，主要来自于真菌和细菌。其中2种主要酶组分是脂肪酶和脂肪酸脱氢酶。 

由于石油能源资源有限，随着世界工业的快速发展，能源消耗急剧增长，全世界都面临着能源安全的问题。目前，已经开发的代用燃料可分为非含氧代用燃料和含氧代用燃料两大类，前者如天然气、液化石油气及氢能源等，后者包括二甲醚、醇类燃料及生物燃料等。这些燃料中，虽然天然气、液化石油气、氢均早已投入使用，但由于使用机械的内部构造以及燃料的补给及贮存等方面的问题，使得它们的应用范围受到很大的限制；二甲醚作为汽油的替代品，可以由一碳原料(如甲醇)直接合成，是一种很有发展前途的产品；醇类燃料如乙醇等也主要用作汽油的替代品种而使用，但成本较高；生物燃料主要用作柴油的替代品。 

生物燃料主要是指由植物中获取的燃料，还包括从其他可再生资源如动物脂肪和已经使用过的油和脂肪中提炼获取的燃料。其中植物油分子一般由14-18个碳的链组成，与柴油分子的组成相似。但植物 油单独用作柴油机燃料时，因粘度较大、热值较低、不饱和脂肪酸非常多，容易形成结胶，堵塞油路等缺点。因此植物油一般不能直接应用于内燃机，必须经过改性处理。比较常见的改性方法有4种：①直接混合法；②微乳液法；③高温裂解法；④酯交换法(即生物柴油)这是目前油脂改性的主要方法。 

生物柴油的主要成分是高级脂肪酸的低级醇酯，即软脂酸、硬脂酸、油酸、亚油酸等长链饱和或不饱及脂肪酸同甲醇或乙醇等醇类物质所形成的酯类化合物。目前，工业生产生物柴油主要是应用酯交换法。在油类酯交换反应中，甘油三酸酯与醇在催化剂作用下酯交换得到脂肪酸甲酯和甘油。因此制备一种生物柴油脂肪复合酶对生物柴油的发展具有重要意义。 

三、发明内容

(1)采用截取少根根霉D6D脂肪酸脱氢酶基因，通过PCR扩增，构建表达载体，最后通过酿酒酵母表达，获得高产脂肪酸脱氢酶菌株。 

D6D脂肪酸脱氢酶是长链多不饱和脂肪酸合成的限速酶。由于天然菌种产酶能力较差，且性能不稳定，副产物多，分离相对比较困难，通常不能被直接用来产酶。为了能够找到高产、优质的菌种，目前国内外常采用基因重组技术克隆脂肪酸脱氢酶基因然后通过真菌表达生产，该法解决了一般的脂肪酸脱氢酶产生菌种培养困难、产酶效率低、酶活力不稳定等问题。利用RT-PCR和RACE方法，从少根根霉中得到全长为1482bp的一段cDNA序列就，通过序列分析和已报道的D6D脂肪酸脱氢酶进行比较，结果显示其开放阅读框编码 的氨基酸序列和卷枝毛霉、高山被孢霉和畸雌腐酶的D6D脂肪酸脱氢酶具有最大同源性。将编码序列构建重组表达载体，并转入酿酒酵母中表达，结果在添加外源性底物亚油酸以及半乳糖诱导后，经GC和GC-MS分析表明，重组细胞特异性的将亚油酸转化为GLA，GLA含量占总脂肪酸含量的3.85％，初步表明该序列的表达产物具有D6D脂肪酸脱氢酶的功能。以上序列和功能分析结果表明，从少根根霉中所克隆的cDNA序列为新的D6D脂肪酸脱氢酶的基因，该项目技术填补了国内空白，技术水平国内领先。通过菌株扩大培养获得的高产脂肪酸脱氢酶菌株，经谱尼测试(北京)有限公司检测酶活力高达90万u/g以上，与现今技术水平获得的酶活力75万u/g，有显著的优异性。 

(2)采用紫外线光照、EMS及LiCl复合诱变青霉菌，定向扩大培养诱变菌株，发酵获得扩展青霉脂肪酶。 

对青霉菌进行紫外光照，选取生长旺盛菌落。用EMS溶液做成孢子悬浮液，加入Na₂SO₃溶液，终止反应。稀释孢子悬浮液，再对其进行紫外光照，筛选旺盛菌种，涂布于含LiCl双层筛选平板。如此反复两到三次，筛选出高产青霉菌种。