[发明专利]脱端基纤维蛋白原及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白质药学领域，特别是一种脱端基纤维蛋白原及其制备方法与应用。 

背景技术

纤维蛋白原(Fibrinogen)又称为凝血因子I，在血浆中的含量为2～4mg/ml，其分子量为34万道尔顿，由3对多肽链组成，多肽链由二硫键连接，形成对称的二体结构，通常用(αβγ)2表示，其α链、β链和γ链分别由610个氨基酸残基、461个氨基酸残基和411个氨基酸残基组成。人纤维蛋白原3条肽链的氨基酸序列已经完成测定(R.F.Doolittle，K.W.K.Watt，1979，Nature.280(9)：464～468)。 

一般将纤维蛋白原的结构划分为中心区(E区)和外围区(D区)，6条肽链的氨基末端(N末端)组成E区。D区和E区之间由三条肽链组成的螺旋结构连接(John W Weisel，2005，Advances in Protein Chemistry.70：247～299)见附图1。 

在血液凝固的最后阶段，凝血酶(Th rombin)催化纤维蛋白原的α链和β链分别水解释放纤维蛋白肽A(FPA)和纤维蛋白肽B(FPB)，从而暴露出结合位点A和B，与相邻的纤维蛋白分子上的互补位点a和b结合，形成纤维蛋白网络。 

据文献研究(J Biol Chem 1993，268(18)：13577～13585；Biochemistry.2007，46(31)：9133-9142)纤维蛋白原α链的羧基末端(C末端)(α链392～610)与E区存在特异性作用，FPA(Fibrinopeptides A，纤维蛋白原α链N末端的16个氨基酸残基组成的多肽，其氨基酸序列为：ADSGE GDFLA EGGGV R)和FPB(Fibrinopeptides B，纤维蛋白原β链N末端的14个氨基酸残基组成的多肽，其氨基酸序列为：QGVND NEEGF FSAR)参与了二者之间的相互作用，当FPA释放后，二者的作用减弱；进一步当FPB释放后，二者的作用更加变小，从而使C末端与E区分开，C末端呈游离状态。游离的α链C末端易于形成两个相邻纤维蛋白分子间的连接。见附图2和附图3。 

目前，一般采用凝血酶(包括人类和哺乳动物来源)或类凝血酶(蛇毒来源)催化水解纤维蛋白原释放FPA和/或FPB后，形成纤维蛋白交联物。由于纤维蛋白交联物为生物来源，具有生物吸收，生物相容和生物降解的优势，常用来制备生物胶，用于止血，组织填充，并且可作为缓控释制剂的包埋剂等。但现有的技术存在以下缺点： 

1.纤维蛋白原溶液不稳定，需要制成冻干粉，冻干粉在使用时溶解缓慢，不利于临床应用。 

2.需要与凝血酶联合应用。人们已经了解牛凝血酶可能携带牛海绵状组织脑炎病原体以及其它使哺乳动物致病的病毒，而且牛凝血酶是一种强抗原，使用牛凝血酶后会在人体引起各种免疫反应。牛凝血酶引发交叉免疫反应所产生的抗体，可能会因其削弱抗凝血酶I(AT-I)的正常抑制作用而导致血栓形成。目前市场上，牛凝血酶都混有牛凝血因子V，进入人体后可发生交叉免疫反应，所产生的免疫复合物经血循环被清除，由此可导致人凝血因子V的缺乏，并可能引起严重出血倾向(李征，1999，华西药学杂志，14(1)：34～36)。有人使用猪凝血酶，但一样存在携带人畜共患病毒等可能。 

3.Tisseel、BeriplastP等几家公司使用人凝血酶制剂，用人凝血酶替代牛凝血酶，但人类携带的各种病毒，例如肝炎、艾滋病等病毒将存在潜在的传播危险。 

发明内容

本发明根据上述领域的缺陷及需求，提供一种不需要凝血酶就能形成纤维蛋白交联结构的脱端基纤维蛋白原。 

一种脱端基纤维蛋白原(CNFg)，包括α、β、γ3对肽链，其特征在于所述α链脱去了N末端1～16位中包括2D、5E、7D，  11E和/或16R在内的氨基酸残基；和/或β链脱去了N末端1～14位中包括5D、7E、8E和/或14R在内的氨基酸残基。 

所述α链的N末端脱去的若干氨基酸残基包括自N末端开始的11～16个氨基酸；所述所β链的N末端脱去的若干氨基酸残基包括自N末端开始的8～14个氨基酸。上述脱端基纤维蛋白原的制备方法，指酶解纤维蛋白原；所述酶解纤维蛋白原采用的酶为氨基肽酶、胰蛋白酶法、V8蛋白酶法、凝血酶或蛇毒类凝血酶。 

所述纤维蛋白原为人或哺乳动物的血液中分离获得，或基因工程方法制备而得。 

所述酶解之后收集丝状纤维蛋白交联物。 

所述收集之后对收集物进行纯化和干燥，所述纯化指水洗所述丝状纤维蛋白交联物。