[发明专利]可表达结核分枝杆菌Ag85B和ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌株及其应用

说明书

技术领域

本发明属于结核疫苗领域。本发明涉及一种可提高疫苗免疫效果的表达Ag85B和ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌株。本发明还涉及所构建菌株在制备结核病预防和治疗方面的制剂或药物中的应用。

背景技术

结核病及基因工程疫苗研究现状

据WHO报告，全世界已有约20亿人感染结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)，其中受耐药菌株感染者可能达到5000万，每年新发患者约1 000万，每年死亡人数高达300万，在所有传染病中结核病(tuberculosis，TB)死亡率仅次于艾滋病。WHO将TB与艾滋病、疟疾一起列为人类最主要的传染性杀手。我国属于全球22个TB高负担国家之一，每年因TB死亡人数约25万，在我国27种法定报告传染病中排第一位，为各种其他传染病和寄生虫病死亡人数总和的2倍。因此，我国卫生部将TB列为全国重点控制的重大疾病之一。

在TB的预防方面，卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin vaccine，BCG)是目前用于TB预防的惟一有效疫苗，主要作为MTB感染前的预防性疫苗，并针对MTB的早期感染，不能预防和控制潜伏感染状态MTB的复发，并且其存在着保护期短，保护性免疫应答较弱等问题，因此亟需研制开发可用于感染者并防止复发的新型TB疫苗。在TB的治疗方面由于TB化疗疗程长达6个月以上，导致患者不能坚持服药和依从性差，并往往引起耐药，特别是出现广泛结核耐药和超级耐药结核菌，这是寻找免疫治疗方法的重要原因。随着对MTB本质认识的逐步深入，已证实TB患者Th1型细胞免疫反应较低，因此可提高机体免疫功能、尤其是Th1型反应的治疗性疫苗具有较好的应用前景。

目前正在开发的TB新型疫苗主要包括亚单位疫苗、基因疫苗、重组BCG疫苗、减毒或增强的全菌体活疫苗、营养缺陷型活疫苗、结合DC的疫苗等，但目前还没有一种新型疫苗可以替代传统的BCG，也没有一种疫苗可广泛用于TB的免疫治疗。目前重组活疫苗是研究最多的TB疫苗，它是将编码MTB保护性抗原的基因导入活的微生物载体构成的。在活疫苗的研究中，如何获得理想免疫效果的疫苗株是研究者最关注的问题，其主要的措施有：第一，选择具有免疫佐剂作用的载体；第二，选择合适的靶抗原。

将外源性基因导入分枝杆菌构建成重组分枝杆菌活疫苗是新型TB疫苗研究的重要方向之一，国内外研究多选用BCG作为分枝杆菌活疫苗载体，但重组BCG疫苗尚存在下述缺点：生长缓慢，营养要求高，培养一代需10多个小时；细胞壁厚，富含脂质，妨碍了外源DNA在内的分子运输；转化效率低；外源基因的表达需特殊载体等。耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis，MS)是一种生长快，转化效率高的非致病菌分枝杆菌和强细胞免疫佐剂，具有与BCG相似的免疫学特性，例如Zhu DY，et al.(RecombinantM.smegmatis vaccine targeted delivering IL-12/GLS into macrophages caninduce specific cellular immunity against M.tuberculosis in BALB/c mice.Vaccine，2007；25(4)：638-648.)等构建了表达IL 12和GLS融合基因的rMS，该重组活疫苗能够刺激T淋巴细胞增殖，启动Th1细胞免疫应答，促使分泌各种细胞因子(IFN-γ、IL-2、IL-12等)，提高机体对病原体的吞噬功能及杀灭作用等。Harth等(High extracellular levels of mycobacterium tuberculosisglutamine synthetase and superoxide dismutase in actively growing cultures aredue to high expression and extracellular stability rather than to a protein-specificexport mechanism.Immunol Cell Biol.2003，87(7)：209-215.)将MTB四种分泌型蛋白的转入MS中进行表达，多种指标检测表明重组蛋白与天然蛋白的生化免疫特性几乎完全相同。Rachael(A new Gatewayvector andexpression protocol for fast and efficient recombinant protein expression inMycobacterium smegmatis.Protein Expression and Purification，2008；57(1)：81-87.)等构建了快速高效的MS表达载体，克隆基因本身的启动子作用下能稳定地表达重组分泌型蛋白，且其产量为BCG的5～10倍。胡佳杰(重组M.S-Sj26GST疫苗有关毒性实验研究。华南预防医学，2002；28(5)：44-45)等检测了重组BCG-hsp70和重组MS-sj26GST对小鼠的毒性，结果表明这两种重组分枝杆菌所诱导淋巴细胞增殖指数较对照组高，小鼠体重、各脏器重量、各血象指标、血清肌酐和ALT含量与对照组无差异。说明此疫苗能提高小鼠的免疫功能，且对小鼠无系统毒性作用。因此，MS是分枝杆菌活疫苗优良载体。