[发明专利]徐淮山羊体外重组过氧化氢酶体激活增殖受体的细胞定位方法

说明书

技术领域

本发明涉及转基因、核移植、动物克隆、种质改良和细胞定位等领域，具体涉及一种徐淮山羊体外重组过氧化氢酶体激活增殖受体的细胞定位方法。

技术背景

过氧化氢酶体激活增殖受体(Peroxisome proliferator-activatedreceptor，PPAR)是配体活化的核转录因子，属于核激素受体家族。它主要参与脂肪的形成，促进脂肪分化和调控特殊脂肪细胞基因的表达，它可能是体内脂质平衡的生理传感器，在维持体内脂质代谢动态平衡中起到枢纽作用。而绿色荧光蛋白(green fluorescence protein，GFP)，特别是绿色荧光蛋白基因可在异源组织中表达并产生荧光，检测方法简单而不影响宿主细胞，因而成为细胞生物学和分子生物学中广泛使用的报告蛋白。通过绿色荧光蛋白与外源基因融合表达的方式，外源蛋白在细胞内的表定位情况旧可由绿色荧光蛋白示踪蛋白产生的绿色荧光来反映。目前，小鼠、猪、牛、绵羊和鸡的过氧化氢酶体激活增殖受体基因已被克隆，而徐淮山羊过氧化氢酶体激活增殖受体基因尚未被克隆，国内关于它的研究主要集中在对其多态性的研究，该基因亚细胞定位还未见有报道。此外，过氧化氢酶体激活增殖受体基因在临床医学研究中有重大的价值。过氧化氢酶体激活增殖受体基因如何参与调控脂肪代谢及其与肥胖、高血脂、脂肪肝等医学难题有怎样的关系，正是科学界亟待解决的问题。克隆出徐淮山羊的过氧化氢酶体激活增殖受体基因并研究其亚细胞定位，是为了保存地方山羊品种遗传资源并为探索过氧化氢酶体激活增殖受体蛋白调控脂类代谢奠定科学基础。

发明内容

本发明目的是克隆徐淮山羊过氧化氢酶体激活增殖受体基因并研究其亚细胞定位，以保存地方山羊品种遗传资源并建立一种基因表达定位的新方法。

本发明可通过以下具体步骤实现：

(1)构建含过氧化氢酶体激活增殖受体基因的载体pMD19-T-PPAR：以徐淮山羊cDNA为模板，F、R为引物PCR扩增全长过氧化氢酶体激活增殖受体基因序列，PCR产物经胶回收试剂盒纯化回收后与pMD19-T连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，LB含氨苄固体培养基培养12-16h后挑选阳性克隆经菌液PCR、酶切鉴定，将含正确插入片段的重组质粒命名为pMD19-T-PPAR，

引物F：5’-CGAAGCTTATGGTTGACACAGAGATGCCGTTT-3’

引物R：5’-CGGAATTCCTAATACAAGTCCTTGTAGATTTCC-3’；

(2)构建含有增强型绿色荧光蛋白的真核表达载体pEGFP-C1-PPAR：用Hind III、EcoR I酶双切鉴定正确的pMD19-T-PPAR，胶回收目的片段，同时用Hind III、EcoR I酶双切原始载体pEGFP-C1，回收目的载体片段；T4 DNA连接酶16℃过夜连接，产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆经菌液PCR、酶切鉴定，将含正确插入片段的重组质粒命名为pEGFP-C1-PPAR；

(3).通过聚乙烯亚胺介导pEGFP-C1-PPAR转染NIH-3T3细胞，48h后于荧光倒置显微镜下观察细胞的发荧光部位，以确定过氧化氢酶体激活增殖受体蛋白的细胞亚定位情况。

综上所述，通过此方法可获得徐淮山羊过氧化氢酶体激活增殖受体基因cDNA完整编码区序列并实现其亚细胞定位。

附图说明

图1：过氧化氢酶体激活增殖受体基因cDNA的PCR扩增结果。其中1：过氧化氢酶体激活增殖受体基因；M：1Kb DNA Marker(MBI公司)

图2是转染pEGFP-C1-PPAR、pEGFP-C1和未转染质粒的NIH-3T3细胞在48h后明、暗场下的图片

A、a：EGFP-PPAR融合蛋白表达在NIH-3T3细胞的细胞质部分；

B、b：EGFP荧光蛋白在NIH-3T3细胞的细胞质和细胞核部分均有表达；

C、c：无荧光蛋白表达的NIH-3T3细胞。

具体实施方法：

1、引物设计与合成

根据GenBank中绵羊过氧化氢酶体激活增殖受体基因序列(登录号：NM001100921)设计全长过氧化氢酶体激活增殖受体基因的cDNA引物，并在上下游引入酶切位点Hind III和EcoR I。引物由上海生工合成，序列如下：