[发明专利]通过定向进化手段获得的RSP_2728酯酶突变基因及酯酶在扁桃酸甲酯拆分反应中的应用

说明书

技术领域

本发明属于酶工程与基因工程领域，具体地说涉及通过定向进化手段获得源于类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)菌株的酯酶RSP_2728基因(GeneID：3720458)的突变体，以及将突变基因与表达载体pET-30a(+)相连接后在大肠杆菌中的表达以及应用。

背景技术

酯酶是一类十分重要的生物催化剂，它能够水解催化一系列酯键并生成相应的酸和醇，其立体选择性是其催化反应的一个重要特性，广泛用于合成食品添加剂、农用化学品和医药中间体等重要手性化合物。酶催化的立体选择性反应是当今手性药物合成研究的热点之一。

从自然界中获得的酶不能达到手性拆分的理想程度，往往具有一定的局限性，因此，通过相关技术提高酶的立体选择性具有重要的意义。在对酶结构或催化机理信息缺乏的情况下，定向进化技术为开发新的生物催化提供了有力的工具。许多研究表明，采用定向进化技术可以提高酶的立体选择性。

发明内容

本发明的目的是提供一种通过定向进化手段获得的RSP_2728酯酶突变基因及其应用。

本发明的目的还在于提供一种通过定向进化手段获得的RSP_2728酯酶突变基因编码的酯酶及其应用。

一种类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)的RSP_2728基因的突变基因，其特征在于，所述突变基因的核苷酸序列是下列核苷酸序列之一：

(1)序列表中SEQ ID NO：1的核苷酸序列；

(2)序列表中SEQ ID NO：2的核苷酸序列；

(3)序列表中SEQ ID NO：3的核苷酸序列；

(4)序列表中SEQ ID NO：4的核苷酸序列；

由突变基因编码的酯酶，所述酯酶的氨基酸序列是下列氨基酸序列之一：

(1)序列表中SEQ ID NO：5的氨基酸序列；

(2)序列表中SEQ ID NO：6的氨基酸序列；

(3)序列表中SEQ ID NO：7的氨基酸序列；

(4)序列表中SEQ ID NO：8的氨基酸序列；

其中，序列表中SEQ ID NO：5的氨基酸序列编码的酯酶命名为XLA，相对于野生型其第62位的天冬酰胺突变成酪氨酸；序列表中SEQ ID NO：6的氨基酸序列编码的酯酶命名为XLB，相对于野生型其第62位的天冬酰胺突变成酪氨酸、第145位亮氨酸突变成组氨酸；序列表中SEQ ID NO：7的氨基酸序列编码的酯酶命名为XLC，相对于野生型其第62位天冬酰胺突变成半胱氨酸、第145位亮氨酸突变成组氨酸；序列表中SEQ ID NO：8的氨基酸序列编码的酯酶命名为XLD，相对于野生型其第62位天冬酰胺突变成半胱氨酸、第121位甲硫氨酸突变成颉氨酸、第145位亮氨酸突变成组氨酸。

酯酶XLA、XLB、XLC或XLD的获得方法，其特征在于：根据SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3或者SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列设计引物，利用PCR扩增的方法获得扩增产物并将其与表达载体pET-30a(+)相连后，转化到大肠杆菌BL21宿主细胞中，经诱导表达后获得重组酯酶。

酯酶的XLA、XLB、XLC或XLD的应用，其特征在于：将所述酯酶用于扁桃酸甲酯的拆分反应，当为酯酶XLA时，其对(S)-型扁桃酸甲酯立体选择性从野生型出发，对映体选择性从E＝3.1提高到了E＝5.3，其对扁桃酸甲酯的活性从野生型出发，从10U/mg提高到了43U/mg；当为酯酶XLB时，其对(S)-型扁桃酸甲酯立体选择性从野生型出发，对映体选择性从E＝3.1提高到了E＝8.8，其对扁桃酸甲酯的活性从野生型出发，从6U/mg提高到了142U/mg；当为酯酶XLC时，其对(S)-型扁桃酸甲酯立体选择性从野生型出发，对映体选择性从E＝3.1提高到了E＝14.0，其对扁桃酸甲酯的活性从野生型出发，从6U/mg提高到了88U/mg；当为酯酶XLD时，其对(S)-型扁桃酸甲酯立体选择性从野生型出发，对映体选择性从E＝3.1提高到了E＝30.8，其对扁桃酸甲酯的活性从野生型出发，从6U/mg提高到了20U/mg。

一种含有酯酶RSP_2728突变基因的转化宿主细胞，它是将含有酯酶基因的重组载体导入到宿主；所述宿主为大肠杆菌DH5α，BL21或者JM109之一。

一种以溴百里香芬兰为指示剂，通过监测酯水解反应所产生的氢离子浓度来确定酶活的高通量筛选方法。