[发明专利]嗜热子囊菌光孢变种61家族内切纤维素酶eg基因克隆及其编码蛋白

说明书

(一)技术领域

本发明涉及生物工程，具体地说是以嗜热子囊菌光孢变种Thermoascusaurantiacus var.levisporus cDNA为模版，以由原始菌株纯化的纤维素酶N端序列及61家族纤维素酶保守位点设计兼并引物，扩增纤维素酶中间片段，后以3’RACE、5’TAIL-PCR的方法得到内切葡聚糖酶eg基因全长cDNA序列及推导的氨基酸序列。

(二)背景技术

纤维素是地球上分布最广、蕴藏量最丰富的物质，是第一大可再生资源。纤维素的生物降解是通过纤维素酶实现的。纤维素酶是一个复合酶系，包括内切-β-1，4-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)(EG)、β-1，4-纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)(CBH)及β-1，4-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)(BGL)。这三种酶协同作用，彻底切割β-1，4-糖苷键，使纤维素最终降解为葡萄糖。其中内切-β-1，4-葡聚糖酶是纤维素酶系最主要的成分，它首先作用纤维素，水解纤维素链非结晶区的β-1，4-糖苷键将纤维素链打开，它对整个纤维素的降解起重要的作用。纤维素酶属于糖苷水解酶类，根据氨基酸序列的同源性以及纤维素酶结构的相似性，将其分成不同的家族，可以反映酶的结构特点，揭示酶的进化关系，并且可以推断酶的作用机理。目前为止，在嗜热真菌中61家族纤维素酶未见报道，克隆该基因对该家族纤维素酶的催化核心、作用机制、空间结构等的研究具有重要意义。

纤维素酶广泛应用于轻工、医药、环保、食品加工、饮料工业、纺织工业、可再生资源的综合利用等方面，被认为是最有应用潜力的酶制剂之。目前国内外纤维素酶主要由嗜温真菌曲霉和木霉生产，但存在菌种产酶量低、活力低、酶稳定性差及成本高等问题，使其纤维素酶的生产和应用受到很大限制。由于热稳定纤维素酶在高温条件下的热稳定，因此具有重要应用前景和商业价值。

嗜热子囊菌光孢变种Thermoascus aurantiacus var.levisporus是一种广泛分布于土壤中的嗜热真菌。该菌在微晶纤维素为唯一碳源的培养基中50℃条件下可以产生热稳定的纤维素酶。

(三)发明内容

本发明从嗜热子囊菌光孢变种Thermoascus aurantiacus var.levisporus获得内切β-1，4-葡聚糖酶基因的全长cDNA序列，命名为eg，eg基因cDNA全长1325bp，包括起始密码子和多聚A尾，具有一个747bp的开放阅读框，编码249个氨基酸。具有信号肽序列(1-21aa MSFSKIIATAGVLASASLVAG)及一个潜在的N糖基化位点(NNS)。

将eg编码的氨基酸序列在国际基因库中进行检索，发现属于糖苷水解酶第61家族，其中3个基序GNYV-RHE，GAQNYPQC和Y-IPGP具保守性。

DNAMAN分析其分子量约为26.5Da，等电点约为5.12。Thermoascusaurantiacus var.levisporus的内切葡聚糖酶EG与丝状真菌亚西岛篮状菌Talaromyces stipitatus、马尔尼菲青霉菌penicillium marneffei的内切葡聚糖酶的同源性较高，达72％。

(四)具体实施方式

实施例1：嗜热子囊菌光孢变种Thermoascus aurantiacus var.levisporus的分离鉴定

(1)标本采集：从堆肥中采集。

(2)分离培养：将采集标本取0.5克放置在PDA平板上50℃培养3天后，进行分离纯化。操作步骤参考Cooney and Emerson(1964)文献。

(3)鉴定：参考Cooney and Emerson(1964)和LaTouche(1950)文献。

实施例2：内切-1，4-β-葡聚糖酶基因eg的克隆

(1)嗜热子囊菌光孢变种Thermoascus aurantiacus var.levisporus总RNA的提取：参照Trizol试剂盒说明。