[发明专利]表达猪源Cre重组酶载体pCEP4-Cre的构建

说明书

技术领域：

本发明涉及一种表达猪源Cre重组酶载体pCEP4-Cre的构建，是利用基因工程技术，建立了能够在细胞内表达Cre重组酶的质粒，用于在细胞内表达Cre重组酶并监测LoxP元件的活性，为建立Cre-LoxP重组酶系统模型提供了监测工具，同时提供了相应的制备方法，属于动物验证学领域。

背景技术：

Cre-LoxP重组酶系统在新型基因打靶中获得广泛应用，是条件性基因打靶、诱导性基因打靶、时空特异性基因打靶策略的技术核心，建立人类疾病动物模型一般需要Cre重组酶以特定的模式表达，例如使用组织特异性启动子。要在细胞内监测Cre-LoxP重组酶系统的活性，需要建立能够在细胞内有效表达Cre重组酶的载体，目前人们使用的Cre重组酶载体多为病毒，但使用病毒载体多不具有安全性和简便性。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种表达猪源Cre重组酶载体pCEP4-Cre的序列SEQ IDNO：1；

本发明的另一目的在于提供一种表达猪源Cre重组酶载体pCEP4-Cre的构建，用于鉴定具有LoxP元件的载体，可以很好的在猪细胞内表达Cre重组酶活性，起到对条件性表达绿色荧光蛋白载体的监测作用，避免了用病毒载体作为鉴定Cre-LoxP重组酶系统的弊端，并且pCEP4-Cre质粒可以在药物筛选(潮霉素B)的压力下以独立于细胞染色体外的游离形式存在于细胞内，避免了对基因组的插入而引起的突变。

本发明技术方案是这样实现的：一种表达猪源Cre重组酶载体pCEP4-Cre的构建，其特征在于：首先采用基因工程的方法构建pCEP4-Cre质粒，并用载体pCEP4-Cre与载体pEF-stop-eGFP共转染进入细胞，在表达Cre重组酶的情况下，将转入到细胞中的载体pEF-stop-eGFP中的Loxp卯定的终止子删除，使后接的报告基因eGFP得以表达，从而用于剪切条件性表达绿色荧光蛋白载体中的LoxP元件；具体制备方法如下：

将LoxP锚定neo和一个终止序列基因，后接EF1α启动子启动的绿色荧光蛋白基因，当与pCEP4-Cre质粒转入细胞后，Cre重组酶表达，将Loxp卯定的终止子删除，使绿色荧光蛋白表达；

1pCEP4-Cre载体构建

1、1用于构建载体的Cre制备

根据Genpank上Cre基因的序列及猪密码子偏爱性设计引物，用重叠延伸PCR将Cre基因拼接出来。将PCR得到的Cre片段的5′端引入到pCDNA3.1上的HindIII酶切位点，Cre片段的3′端引入到pCDNA3.1上的EcoRI酶切位点。

1、2载体pCEP4-Cre的制备

分别用HindIII和XhoI双酶切载体pCEP4和pCDNA3.1-Cre，得到的Cre片段的5′端引入到pCEP4上的HindIII酶切位点，Cre片段的3′端引入到pCEP4上的XhoI酶切位点，并委托北京天根公司进行测序，测序完全正确。

2、pEF-stop-eGFP载体构建

将已有质粒pGKneotpAlox2中两loxp位点间的序列切下连接到pEF-GFP质粒中eGFP的启动子EF1α后。

所述的LoxP元件是在细胞水平通过细胞转染及荧光显微观察可以特异性检测条件性表达绿色荧光蛋白载体中的LoxP元件。

通过以下试验例证明本发明的效果：

试验例1pCEP4-Cre、pEF-stop-eGFP载体瞬时转染猪胚胎成纤维细胞的检测---荧光检测

1成纤维细胞系  将所构建的载体pCEP4-Cre和pEF-stop-eGFP瞬时转染中国长白猪胚胎成纤维细胞。

2试验过程  培养细胞至70～80％左右进行转染，将1号孔细胞瞬时转染pEF-stop-eGFP质粒做为阴性对照、2号孔细胞瞬时共转染pCEP4-Cre和pEF-stop-eGFP、质粒、3号孔细胞瞬时转染pEF-GFP质粒做为阳性对照、4号孔细胞作为空白对照。并用含10％FBS血清的培养基培养。5％CO2培养箱中培养24H、48H时，在荧光共聚焦显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况。

3试验结果  单独转染pEF-stop-eGFP质粒的阴性对照细胞不表达绿色荧光蛋白，共转染pCEP4-Cre和pEF-stop-eGFP质粒的细胞中Cre重组酶切除Loxp卯定的终止子以后，绿色荧光蛋白表达。结果如下

见图1Cre重组酶切除stop序列以后，绿色荧光蛋白的表达情况。