[发明专利]抗铜绿假单胞菌外膜蛋白单克隆抗体的制备方法

说明书

(一)技术领域

本发明属于医学研究领域，特别涉及一种抗铜绿假单胞菌外膜蛋白单克隆抗体的制备方法。

(二)背景技术

铜绿假单胞菌是一种重要的医源性感染菌，其导致的感染占革兰阴性菌感染的10％，常继发于肿瘤、大面积创伤、烧伤及使用免疫抑制剂等机体免疫力低下的患者，它的感染类型多样，可侵害呼吸道、消化道、泌尿系统、骨髓和皮肤等部位。

用传统的细菌分离方法鉴定铜绿假单胞菌，耗时长，结果容易受到抗生素治疗和样本收集不当的影响，方法的敏感性较低；如何使用免疫学的方法快速有效地检测铜绿假单胞菌感染，目前已被研究人员广泛关注，而用免疫学方法检测铜绿假单胞菌抗原，其基础是要获得高特异性、高效价的单克隆抗体。

(三)发明内容

本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种特异性高、敏感性强的抗铜绿假单胞菌外膜蛋白单克隆抗体的制备方法。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种抗铜绿假单胞菌外膜蛋白单克隆抗体的制备方法，主要包括如下步骤：

(1)利用分子生物学方法克隆OprF基因，诱导表达并纯化OprF；

(2)用OprF免疫BALB/C小鼠后通过杂交瘤技术制备特异性的mAb(单克隆抗体)，并用ELISA法(酶联免疫吸附测定法)测定mAb的免疫活性；

(3)建立检测铜绿假单胞菌的双mAb夹心ELISA方法，并对其敏感性、特异性进行初步评价。

其中，步骤(1)中，OprF基因通过Ni-NTA-His亲和层析柱纯化。

本发明的单克隆抗体能特异性结合铜绿假单胞菌，与其它细菌无交叉反应。该抗体与铜绿假单胞菌结合效率高，效价高达1∶10⁵。

本发明利用杂交瘤技术制备出了特异性高、敏感度强的新型抗铜绿假单胞菌OprF蛋白单克隆抗体，为今后通过免疫学方法快速、特异性的检测铜绿假单胞菌感染奠定了实验基础。

(四)附图说明

下面结合附图对本发明作进一步的说明。

附图为本发明的操作步骤示意图。

(五)具体实施方式

实施例：

利用所构建的原核表达载体Pet-28b-OprF，诱导表达OprF蛋白；将表达后的蛋白经超声碎菌后，用Ni-NTA-His亲和层析柱纯化，用纯化后的重组蛋白OprF加入等体积的完全福氏佐剂进行充分乳化，经腹部和背部皮下注射免疫4只BALB/c小鼠，间隔10d免疫一次，共免疫4次；细胞融合、筛选、有限稀释法、克隆化及腹水的制备纯化，均按杂交瘤技术常规方法进行。

分别对所制备的单克隆抗体急性以下几方面的鉴定：①单克隆抗体的浓度；②单克隆抗体的类别和亚类；③单克隆抗体的效价；④单克隆抗体的亲和常数。最后选定两株单克隆抗体，采用双单克隆抗体夹心ELISA法检测铜绿假单胞菌，进行利用单克隆抗体检测临床标本中铜绿假单胞菌感染的初步探索。