[发明专利]5’-RACE接头序列添加方法及接头序列和5’端未知基因完整编码序列的扩增方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种接头序列添加方法及接头序列和基因完整编码序列的扩增方法。

背景技术

若要克隆编码区仅3’端一侧的序列已知的基因，需要先获得5’端一侧的未知序列，进而获得完整的编码序列。如今，RACE技术是根据基因已知的部分序列扩增未知片段的最佳方法。RACE技术(rapid amplification of cDNA ends，RACE)概括地说就是通过逆转录和PCR的有机结合，扩增基因未知片段的技术。利用基因编码区3’端的已知序列，获得5’端未知序列的技术称为5’-RACE，是如今扩增5’端未知基因完整编码序列的最常用技术。

5’-RACE基本原理：首先获得包含目的基因mRNA的RNA样品，并利用基因特异的引物进行逆转录，获得目的基因相应的cDNA；在cDNA的3’末端(对应mRNA序列5’末端)加上特定的序列，通常将这段添加在cDNA上的特定序列称为接头(adaptor)，同时合成与adaptor序列相匹配的引物，称为锚定引物；然后利用基因已知序列设计基因特异性引物，与锚定引物配对进行PCR扩增，得到未知部分的片段；再将扩增得到的片段测序，即可获得目的基因未知部分的序列。

目前按接头序列的添加方法可分为3大类：末端转移酶法(terminaldeoxynucleotidyl transferase method，TdT method)、接头连接法(adaptor ligation)和寡核苷酸帽法(oligo caping method)。近年出现了一些可同时扩增编码区3’一侧与5’一侧未知片段的技术，并推出了相应的试剂盒，如GeneRacer(Invitrogen公司)、SMART RACE(Takara-BD公司)等。这些技术的基本原理是用oligo(dT)起始逆转录，在完整mRNA逆转录所得的完整cDNA产物的3’端及5’端分别添加3’-adaptor及5’-adaptor，使所有完整的cDNA在两端都带有adaptor，成为包含所有基因信息的通用模板。再利用目的基因的特异引物与某一端的锚定引物搭配，则可利用同一份通用模板获得不同基因、不同末端的未知序列。

采用末端转移酶法和接头连接法存在一个共同的问题，就是会在逆转录所得的所有cDNA的3’末端都加上adaptor，无法区分5’端完整与不完整的mRNA，也无法区分逆转录进行得完全与不完全的cDNA，因此不能保证mRNA5’末端信息的完整。这样，若要获得基因编码区完整5’末端的信息，往往需要进行不只一次的“逆转录-添加adaptor-PCR-测序”过程，每次需根据上一次测序所得的序列设计新的逆转录引物，也就是需要进行多轮RACE。此外，这两种方法都需要先将逆转录产物进行纯化，才能添加adaptor，而cDNA在纯化过程中会发生损失，因此需要制备较大量的cDNA。

虽然寡核苷酸帽法可以选择性地对5’端完整的mRNA进行扩增，解决了末端转移酶法和接头连接法对mRNA完整性无选择性的问题。但寡核苷酸帽法存在需要对RNA进行多步操作，在各步的酶反应之间又都需要对RNA进行纯化，而且RNA很容易被降解，因此很容易损失掉大量的RNA，从而降低了此后RACE工作的效率，对于丰度较低的mRNA，甚至很难得到扩增产物。

利用通用模板作为起始材料，虽然可高通量地进行基因克隆，但是若仅需要通过5’-RACE扩增少数5’端未知基因编码区的未知片段，通用模板并不适合。原因有如下2点：

首先，通用模板的复杂性很高。通用模板对基因没有选择性，所有基因的完整cDNA均添加有adaptor，理论上包含所有基因对应的cDNA。在复杂的模板中，目的基因cDNA含量相对较低，对于表达丰度较低的基因，克隆难度则更大。而且，模板越复杂，PCR反应中越容易发生非特异扩增，影响目的片段在PCR反应中的扩增效率，非特异的扩增产物还会干扰目的条带的选择。

其次，通用模板制备过程中，信息损失的可能性较大。这是因为，通用模板对RNA以及逆转录反应的完整性要求都很高，不完整mRNA的逆转录产物以及逆转录反应中链延伸不完全的cDNA都不会被添加adaptor；而逆转录反应的链延伸过程又很容易发生未成熟终止，若待延伸的mRNA模板较长，或具有较复杂的二级结构，则未成熟终止的可能性较大。制备通用模板时逆转录反应需要从mRNA的3’末端一直延伸到5’末端，对于编码区较长的基因，很难得到基因的完整cDNA。这些都会增加5’-RACE的工作量，并可能影响5’-RACE结果。