[发明专利]蛋白酶激活受体激动剂的制备方法及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白酶激活受体激动剂的制备方法及其用途，即三叶因子(trefoil factor，TFFs)及其衍生结构作为蛋白酶激活受体(protease-activated receptors，PARs)的激动剂在细胞迁移及创伤修复制药中的应用；本发明同时提供三叶因子和蛋白酶激活受体表达变异在临床胃肠道肿瘤疾病检测中的应用，属生物医学领域。

背景技术

蛋白酶激活受体(protease-activated receptor，PAR)属于单链七次跨膜的G蛋白偶联受体(GPCR)家族。目前为止，一共有四种PAR亚型被发现，分别是PAR1、PAR2、PAR3和PAR4，除了PAR2为胰蛋白酶激活受体外，其他三个都是凝血酶的受体。在不同细胞类群中，PAR受体的表达存在差异，如人血小板仅表达PAR1和PAR4，胃癌细胞株AGS本身不表达PAR4，而HT-29细胞株则表达PAR1、PAR2和PAR4。PAR受体在血液循环系统、呼吸系统、神经系统和消化系统中都发挥了重要的功能，与心血管疾病、癌症、神经退行性疾病等密切相关。凝血酶受体1(PAR1)参与正常的血小板聚集过程，PAR1激动剂可诱导人血小板聚集，涉及Ca²⁺动员和促凝活性的增强，可用于止血药物的开发。蛋白酶受体在神经元和星形胶质细胞的存活中具有重要的作用，特别是涉及到损伤和炎症中神经元的功能。PAR1激动剂可极大地保护星形胶质细胞和海马神经元，避免包括低血糖症和氧化应急环境刺激引起的死亡。PAR1激活可引起身体镇痛，其激动剂可望用于镇痛药物的开发。雾化剂给予PAR4激动剂可抑制5-羟色胺(5-HT)诱导的支气管痉挛，抑制组氨诱导的气道阻力增加，目前PAR4激动剂正进行治疗哮喘药物的开发。PAR1在损伤修复中起作用，PAR1激活剂局部应用到损伤组织中可促进血管生成，具有促进损伤愈合的功能。总而言之，蛋白酶受体1和4的激动剂在制药中具有广泛的应用前景。

细胞迁移是机体正常生长发育必不可缺的生理过程。组织修复再生、创伤修复的过程中离不开它。在上皮愈合的过程中，涉及细胞脱落和调亡，基质暴露，细胞和细胞间连接的解聚，细胞迁移和细胞连接的重构的过程。三叶因子(trefoil factor，TFF)为一类含有一个或者多个三叶因子结构域的分泌型的蛋白质，三叶因子结构域由大约38～39个氨基酸残基组成，含有6个半胱氨酸，以1-5，2-4，3-6的形式形成二硫键。人三叶因子含有三个成员，分别是三叶因子1(TFF1)、三叶因子2(TFF2)和三叶因子3(TFF3)。三叶因子1和三叶因子3只含有一个三叶因子结构域，而三叶因子2含有两个三叶因子结构域。三叶因子广泛地分布在胃肠道上皮及其他的上皮系统中，与粘膜保护，损伤修复和肿瘤抑制密切相关。三叶因子为潜在的肿瘤抑制因子。三叶因子1，2和3均能够促进细胞迁移和伤口修复，在胃肠道粘膜的损伤修复中起到重要的作用。

肿瘤难以治愈的一个主要难题在于肿瘤细胞的恶性转移。肿瘤细胞不断地从一个器官/组织转移到新的器官/组织，使其病变，坏死，最终威胁生命。胃肠道肿瘤是临床上的常见病、多发病，严重威胁着人民的生命和健康。我国是世界上胃癌高发国家，全世界约35％的胃癌病例发生在中国，每年死于胃癌患者超过26万例，占所有癌症死亡的1/5，在我国，大肠癌发病率每年递增4.2％，比全世界每年递增2％还高一倍，我国结直肠癌患者死亡率居癌症死亡的第五位。肿瘤的早期诊断和病程检测是临床治疗的重要指标，对于疾病的治疗和病人的预后非常重要。

发明内容

本发明的目的是提供蛋白酶激活受体激动剂的制备方法及其用途，即两栖类三叶因子Bm-TFF2和人三叶因子2及它们的衍生结构作为蛋白酶激活受体的激动剂在细胞迁移及创伤修复制药中的应用，人三叶因子2和蛋白酶激活受体4表达变异在临床胃肠道肿瘤疾病检测中的应用，可用于生物医学试剂制备，制药和临床检验等领域。

本发明的蛋白酶激活受体激动剂的制备方法包括：蛋白酶激活受体激动剂的制备方法包括：1)该激动剂是两栖类物种大蹼铃蟾的三叶因子Bm-TFF2、人三叶因子2；2)利用PCR技术获取所需的Bm-TFF2或人三叶因子2基因全序列并将它们分别插入原核表达载体pET-32a(+)中；3)在大肠杆菌原核表达系统中高效表达了Bm-TFF2以及人三叶因子2；4)通过对表达菌株裂解液亲和层析得到可溶性融合蛋白TRX-Bm-TFF2以及人三叶因子2；5)融合蛋白经第X因子蛋白酶酶切后再经镍亲和柱纯化，得到纯化的Bm-TFF2以及人三叶因子2。