[发明专利]海南隔指孢的丝氨酸蛋白酶基因及其克隆方法和应用

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及一种新的食线虫真菌来源的胞外丝氨酸蛋白酶基因及其克隆方法。

背景技术

植物寄生线虫是一类重要的植物病原微生物，每年造成巨大的损失。目前主要采用杀线虫剂防治植物寄生线虫，但杀线虫剂通常毒性较高，污染环境。植物线虫的生物防治越来越受到人们的重视。在线虫生物防治中，食线虫真菌是一类非常重要的线虫生防资源，目前已有包括线必克等商品化的线虫生防制剂上市。

真菌是植物线虫生物防治中研究较多的天敌生物，也是最为重要的生防因子之一。研究表明海南隔指孢对防治线虫有很好的效果。在线虫侵染过程中，无论是对于线虫虫体或者虫卵来说，覆盖于其表面的体壁或卵壳都是防止侵染的重要保护结构。研究表明，在食线虫菌物侵染线虫的过程中，主要是机械作用与蛋白酶水解酶共同作用的结果，其中显微结构和组织化学的研究表明，至少在线虫体壁的刺入、线虫被侵入、线虫的消化等过程中均有蛋白酶和水解酶的参与。蛋白酶能有效地降解线虫体壁，协助完成侵染过程，是线虫侵染的重要毒力因子。

因此，从食线虫菌物中获取蛋白酶基因，利用生物基因工程技术对现有的生防菌株基因组DNA进行改造，增加蛋白酶基因的拷贝数和表达水平，对提高生防菌的防效具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是通过对一株海南隔指孢真菌的研究，从食线虫菌物中获取蛋白酶基因，利用生物基因工程技术对现有的生防菌株基因组DNA进行改造，增加蛋白酶基因的拷贝数和表达水平，提供一种新的丝氨酸蛋白酶编码基因。

本发明的另一个目的是提供所述基因的克隆方法。

本发明还有一个目的是提供所述基因的应用。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现：

提供一种海南隔指孢的丝氨酸蛋白酶基因，具有表SEQ ID NO：1所示序列或表SEQ ID NO：3所示序列。

本申请人从感染根结线虫的空心菜根结土壤中分离得到的一株对线虫具有很好毒杀作用的隔指孢属新种，命名为海南隔指孢(Dactylellahainanensis lg21-1)。菌株于2010年2月4日保存于中国湖北武昌珞珈山中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2010042。

根据对GenBank所报道的食线虫真菌来源的丝氨酸蛋白酶的同源性分析，设计了四条兼并引物，以海南隔指孢的基因组DNA作为模板扩增得到蛋白酶编码基因的保守序列，并通过RACE技术扩增得到3′端和5′端未知的基因序列，把序列拼接得到海南隔指孢胞外丝氨酸蛋白酶编码基因的全序列。

所述基因的获得包括以下步骤：

(1)收集固体培养基扩大培养的海南隔指孢，采用CTAB法提取总DNA；

(2)选择GenBank上真菌丝氨酸蛋白酶cDNA序列保守区，利用ClustalX软件进行同源性分析，设计二对兼并引物，以海南隔指孢基因组DNA为模板进行PCR扩增；

(3)利用RACE技术扩增蛋白酶3′端和5′端未知的基因序列；

(4)根据cDNA全长序列设计一对覆盖ORF的特异引物，分别以海南隔指孢cDNA和DNA为模板进行扩增。扩增获得海南隔指孢的DhCSP的cDNA序列1218bp，序列表如SEQ ID NO：1，基因组编码区序列1270bp，编码区包含1个内含子，序列表如SEQ ID NO：2。此外，DhSLP的cDNA序列1577bp，序列表如序列表如SEQ ID NO：3，基因组编码区序列1899bp，编码区包含2个内含子，序列表如SEQ ID NO：4。

所述的海南隔指孢所述海南隔指孢(Dactylella hainanensis lg21-1)，(D.hainanensis)，菌株形态特征为：CMA培养基上生长，菌落近无色，生长较缓慢，25℃暗培养11d，菌落可达6.8cm；周边菌丝透明，有隔，通常宽度在2.5～4.5μm。分生孢子棒状，顶端钝圆，长17.7～40.5(27.7)μm，宽4.8～10.1(7.0)μm，分生孢子多数为孢子梗顶部单端生，少顶部多生，最多不超过4个，分生孢子梗无色，直立，有分隔，长146.7～260.6μm，基部宽2.0～4.0μm，端部约2.0μm，端部少数顶部分枝。分生孢子有0～4个隔，大多数1～3个分隔。老熟菌丝易生厚垣孢子，厚垣孢子近圆形，直径大小一般在7.5～12.5(11.3)μm。菌株的捕食器官为黏性球，黏性球的柄长5～27.5μm，柄宽2.3～3.2μm，球部长5.0～10.0μm，宽4.5～9.0μm。多数黏性球的柄垂直伸出菌丝生长。