[发明专利]一种检测无鳞鱼致病菌温和气单胞菌的方法和检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种鱼类致病菌的检测技术，特别是无鳞鱼致病菌温和气单胞菌的检测方法和检测试剂盒以及相应的引物。

背景技术

随着大口鲶、斑点叉尾鮰等名贵经济无鳞鱼的高密度养殖，细菌性疾病的发生日益严重，特别是苗种阶段尤其明显。因此，只有不断地完善防治方法，认真贯彻“全面预防，积极治疗”的方针，才能收到预期的防病效果。预防疾病的一个重要基础是判断养殖水体中或鱼体内中是否存在某些特定的鱼类致病菌以及已经存在的致病菌的种类和数量，从而才能够采取合适的方法对症下药。因此，如何快速、准确地检测和判断某些细菌的感染，以有助于阐明其致病机理，及时治疗和控制鱼病的发生，一直就是众人所努力攻克的难题。

目前，针对致病菌的检测和诊断技术多种多样，包括选择性培养基鉴别培养法、酶联免疫吸附试验(ELISA)、斑点酶联免疫吸附试验(DOT-ELISA)、单克隆抗体技术(Monoclonal Antibody Technique)等。这些方法各有其特点，但在生产应用中多表现出培养时间较长、只能用于粗略检测，不甚精确、敏感性和特异性差等不足。而在检测和诊断技术中，聚合酶链反应(PolymeraseChain Reaction，PCR)因其具有的简便、快速、敏感、特异、适于早期和大量样品检测的优点，已在该研究领域得到广泛应用。但是对于无鳞鱼中斑点叉尾鮰和大口鲶主要致病菌柱状黄杆菌和温和气单胞菌，目前国内尚没有相关的PCR检测技术方面的研究报告。

为了及时监控无鳞鱼养殖中的鱼病发生，迫切需要一种能快速检测鱼体内或养殖水体中是否存在致病菌的技术。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种检测无鳞鱼致病菌的试剂盒，包含引物B，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1-2所示，扩增来自温和气单胞菌(Aeromonassobria)的基因。

所述试剂盒还含有如SEQ ID NO：3所示核苷酸序列的阳性对照物。

本发明的另一目的是提供一种检测无鳞鱼致病菌的方法，包括以下步骤：

1)提取待检样本中的DNA；

2)用引物对样本中的DNA进行扩增，所述引物的核苷酸序列如SEQ IDNO：1～2所示；

3)用SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列制备标准阳性模板，并进行稀释和定量；

4)对DNA扩增结果进行检测。

本发明方法步骤1)所述的待测样本取自鱼体或养殖水体。

本发明的再一个目的是提供一种选自如SEQ ID NO：1～2所示寡核苷酸序列的用途，其用于扩增或检测来自温和气单胞菌的基因。

附图说明

图1温和气单胞菌常规PCR测试引物及检测体系

11-19：引物对AS1F/AS1R，11-13为空白对照；

21-29：引物对AS2F/AS2R，21-23为空白对照；

31-39：引物对AS3F/AS3R，31-33为空白对照；M：DNA marker I.

图2温和气单胞菌常规PCR检测体系的特异性

1-2：空白对照；3：豚鼠气单胞菌ATCC 15468；4：嗜水气单胞菌；5：荧光假单胞菌；6：河弧菌；7：柱状黄杆菌；8-9：温和气单胞菌；M：DNA markerI.

图3温和气单胞菌常规PCR检测体系的灵敏度

1-7：基因组DNA从50纳克到50菲克的10倍梯度稀释；8：空白对照；M：DNA marker I.

图4草鱼样品检测结果(温和气单胞菌)

1：空白对照；2-14：鱼池采集的样品；15：阳性对照；M：DNA marker I.

图5鲤鱼样品检测结果(温和气单胞菌)

1：空白对照；2-8：待检测样品；9：阳性对照；M：DNA marker I.

图6水体中温和气单胞菌检测结果

1：空白对照；2-5：待测水样，6：阳性对照；M：DNA marker I

具体实施方式

根据已有文献资料报道，温和气单胞菌为常见的鱼类致病菌，在养殖无鳞鱼的发病鱼体和养殖水体中常常存在，因此，我们选取温和气单胞菌作为研究靶标，以PCR作为技术手段，以这些菌株的保守毒力基因序列作为靶标序列，研究和建立PCR快速检测技术体系，从基因水平上，通过多学科的联合研究，在鱼致病性细菌的早期、快速、定量检测方面进行一些积极的探索，加强鱼病的预防和诊断。

以下实施例是为了对本发明作进一步详细说明，并非对发明的限制。