[发明专利]一种双路频分复用荧光共焦显微成像系统及实现方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种成像技术，特别涉及一种双路频分复用荧光共焦显微成像系统及实现方法。

背景技术

Marvin Minsky于1957年首次提出了共焦成像的概念，希望克服传统荧光显微镜的一些局限性。共焦显微镜采用点光源照明，并用探测器之前的与光源成共轭关系的孔径来滤去焦外信号——“共焦”一词也正基于此。随后，各类共焦显微镜层出不穷，如1970年的第一台单光束的共聚焦激光扫描显微镜，1990年的双光子激光扫描显微镜等。过去十几年间又相继涌现出了三维数字共焦拉曼显微镜、光纤耦合多路复用共焦显微镜以及使用光子晶体光纤产生的超白光作激励光源的彩色共焦显微镜等新型共焦显微镜。这些显微镜在继承和发展共焦显微成像技术的同时，提高了共焦显微成像的性能，如横向和纵向分辨率，扫描探测速度等性质。继波分复用荧光共焦成像概念被提出以后，2006年由美国宾夕法尼亚州州立大学电子工程系Shizhuo(Stuart)Yin教授课题组提出了多点并行探测的频分复用荧光共焦显微成像的概念。也就是利用频分复用技术和荧光共焦技术的结合实现多点并行快速多通道实时细胞探测。

发明内容

本发明是针对现有传统的共焦显微镜时间分辨率低，扫描速度慢的问题，提出了一种双路频分复用荧光共焦显微成像系统及实现方法，此共焦显微成像系统具有高的空间分辨率和时间分辨率，并且实现双点荧光信号的同时探测。

本发明的技术方案为：一种双路频分复用荧光共焦显微成像系统，包括双路频分复用荧光共焦显微镜和信号采集处理系统，双路频分复用荧光共焦显微镜采集的信号先经采集信号处理系统中电压放大电路，后经数据采集卡进行信号放大、模数转换，最后输入电脑处理得到信息。

所述双路频分复用荧光共焦显微镜包括显微物镜、三个分光棱镜、一个二向色镜组、光电倍增管、成像透镜、CMOS摄像机、两个反射镜、两个斩波器，激光光束首先通过第一反射镜和第一分光棱镜被分成强度相同的两束，送入两个调制频率不同的斩波器分别进行调制，然后再通过第二反射镜和第二分光棱镜(8)将两束光合成一束，将合成光束通过第三分光棱镜，得到两束激发光照射到位于显微物镜焦平面上的生物样品上，生物样品产生两束荧光随后反向通过显微物镜聚光，再次通过二向色镜组，进入第三分光棱镜，分为强度相同的两束，其中一束通过消色差成像透镜，聚焦后进入位于透镜的焦平面位置上的CMOS摄像机，另一束则进入光电倍增管。

一种双路频分复用荧光共焦显微成像实现方法，包括双路频分复用荧光共焦显微成像系统，方法具体包括如下步骤：

1)将准直半导体激光器发出的紫色405nm激光光束通过扩束镜扩束形成直径为10mm的平行光束，再通过第一分光棱镜，把光束分为两束等强度光束，其中一束为透射光，另外一束经过第一反射镜反射，调节第一反射镜的位置，使反射光与透射光束平行；

2)在这两束光传播过程中，引入双通道光斩波器，每个通道分别用不同的斩波频率调制斩波，然后继续将其中一束使用第二反射镜将光束转折90°传播，两束光从两个垂直方向同时通过第二分光棱镜合光得到重合的一束激光；

3)从第二分光棱镜中出射的一束光进入二向色镜组中，二向色镜组由二向色镜、荧光滤色片和激发光滤色片组成，能分别使激光器发出的405nm激光和荧光，单方向从二相色镜出射，将被调频的双路激发激光通过40倍的无限远显微物镜聚焦后照射在样品上，产生双点激发荧光信号，将生物样品固定在三维调节架的平台上，通过调整三维调节架调整样品与显微物镜的距离，使样品恰好处于光焦点所在位置并且保持显微物镜与样品的垂直关系；

4)从样品中发出的双点荧光信号具有同各自的激发激光束相同的频率，再通过二向色镜组将发射回来的激发激光过滤后，出射的荧光信号进入第三分光棱镜，其中一束荧光耦合入消色差成像透镜后进入位于透镜焦点处的彩色CMOS摄像头；另一束荧光进入光电倍增管，然后接入电压放大电路，通过数据采集卡将采得的信号送入计算机中进行采集和处理；

5)信号处理的步骤是首先对采集信号进行傅立叶变换，得到频谱信息，然后进行选频滤波，根据调制信号频率将两束荧光信号的频谱信息挑选出来，然后再进行傅立叶逆变换得到解调的双路荧光随时间变化信息。