[发明专利]一种适应性广的蛋白酶的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种蛋白酶的制备方法，尤其是涉及一种适应性广的蛋白酶的制备方法。 

背景技术

蛋白酶是催化肽键水解的各种酶的总称，广泛来源于微生物、植物茎叶果实、动物内脏等。最早研究蛋白酶的典型代表是1908年的德国Rohm等人，1911年美国华勒斯坦公司首次以木瓜蛋白酶作为啤酒澄清剂使用，20世纪30年代以来，通过微生物工程技术提取蛋白酶成为蛋白酶制剂的主要来源，目前，全世界酶制剂总产量在2000万吨以上，其中20%左右是蛋白酶。已作成结晶或高纯度的蛋白酶有200多种，其一级结构甚至立体三级结构也已阐明。 

蛋白酶用途极为广泛，在饲料工业、食品工业、纺织工业、造纸工业等领域的应用产生了极为显著的经济效益和社会生态效益。目前我国酶制剂产量仅占世界总产量的2%左右，主要是糖化酶、淀粉酶、碱性蛋白酶等酶类，国内碱性蛋白酶现在已达到1.4万吨左右的年产量。根据蛋白酶活力pH值适宜范围，蛋白分可分为三类：酸性蛋白酶，最适pH值一般为4-5；中性蛋白酶，最适pH值一般为6-7；碱性蛋白酶，最适pH值一般为8-10。每类蛋白酶只有在其适宜的酸碱度（即适宜的pH范围）环境中才能发挥其催化肽键水解的功效，而实际生产应用中，往往不可能只有一种酸碱度环境。

因此，目前不管以哪种方式生产的蛋白酶，其主要缺陷是：1、应用pH适宜范围窄，只能在某类产品中应用；2、生产成本相对较高。

 发明内容

本发明的目的在于克服现有蛋白酶制备方法存在的上述缺陷，提供一种适应性广的蛋白酶的制备方法。 

 本发明的目的通过以下技术方案予以实现：其包括以下操作步骤： 

 （1）枯草杆菌菌种复壮培养：1）复壮培养基配制：复壮培养基配方：蛋白胨0.9-1.1wt％，牛肉膏0.5-0.7wt％，NaCl0.3-0.5wt％，琼脂2wt%,pH8.5-10.0，其余为水；将所述配料混匀，分放于培养皿中，0.1Mpa120-122℃灭菌30-35min，冷却到室温，制成复壮培养基，备用；2）接种与培养：将实验室保存的产蛋白酶的枯草杆菌环移取1-2环，接种到所述复壮培养基，置于36℃±1℃恒温培养60-70h，得复壮菌种，取出低温保存；

（2）枯草杆菌种子培养：1）种子培养基配制：种子培养基配方：葡萄糖0.4-0.6wt%，蛋白胨0.4-0.6wt％，酵母膏0.4-0.6wt％，磷酸二氢钾0.05-0.08wt%,硫酸镁0.01-0.02wt%,氯化钠0.3-0.5wt％，其余为水，pH8.5-10.0，将所述配料混匀，0.1MPa120-122℃灭菌30-35min，冷却到39-41℃，制成种子培养基，备用；2）种子培养方法：取复壮的枯草杆菌菌种接种，接种量按种子培养基重的1-2wt%计，接种到冷却至39-41℃的种子培养基，36℃±1℃恒温培养60-70小时，恒温培养时，不断搅拌通风，搅拌速度为300-320转/分钟，通风量为1.3-1.4立方气体/升培养基/分钟，制成枯草杆菌种子培养液；

（3）液态深层发酵培养：1）液态深层发酵培养基配方：葡萄糖4.0-6.0wt%，MgS0₄0.01-0.02wt％，Na₂HPO₄ 0.20-0.30wt％，蛋白胨0.15-0.25wt％,黄豆粉2.0-3.0wt%，pH8.5-10.0，其余为水；将配料混匀后，0.1MPa120-122℃灭菌30-35min，冷却到39-41℃，制成液态深层发酵培养基，备用;2)液态深层发酵培养：取枯草杆菌种子培养液接种,种子培养液的接种量按液态深层发酵培养基重的2-3wt%计，接种到冷却到39-41℃的液态深层培养基，36℃±1℃恒温培养60-70小时，恒温培养时，不断搅拌通风，搅拌速度为300-320转/分钟，通风量为1.3-1.4立方气体/升培养基/分钟，制成枯草杆菌液态深层发酵培养液；

（4）粗滤：往枯草杆菌深层发酵培养液中添加相当于发酵培养液重3-5%的硅藻土，混合均匀，板框压滤，得粗滤液；

（5）粗滤液膜浓缩：以微滤膜将粗滤液过滤浓缩至其原重量的1/4-1/5，制得浓缩液；

（6）冷冻干燥：将浓缩液在-30℃下冷冻，抽真空干燥成粉末，即成。

 所述枯草杆菌为公知常见微生物（参见《酶制剂工业》下册，张树政主编，科学出版社1998年第三次印刷,395页）。