[发明专利]一种利用流式细胞仪检测腹腔吞噬细胞活性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞生物实验技术领域，更具体的说，是涉及一种利用流式细胞仪的快速、准确的特点来检测腹腔吞噬细胞活性的方法。

背景技术

腹腔吞噬细胞对于机体抵御病原体的入侵起着重要的作用。吞噬细胞属于非特异性免疫细胞，能够非特异性的吞噬进入人体内的病原体，衰老病变细胞，参与抗原识别与递呈，生成多种细胞因子，在机体的固有免疫中发挥重要作用。因此，检测吞噬细胞活性对于药物的筛选和功能性食品的开发具有极其重要的意义。而传统的检测吞噬细胞的活性主要有吞噬鸡红细胞和酵母的方法，由于这些方法费时、工作量大，受人的主观因素影响比较大，观察的数量较少，一般只计数100个吞噬细胞，所以存在一定误差。

目前，用流式细胞仪来检测吞噬细胞活性已经越来越受到人们的关注。由于流式细胞仪检测速度可达每秒10,000个左右的细胞，共计数20,000个细胞，极大的提高了检测的准确性，并为样本数量较多的实验设计提供了一个快速、准确、可行的实验方法。自1982年Steinkamp首创荧光微球流式细胞术定量检测吞噬细胞吞噬功能以来，到目前为止，发展起来的技术方法也很多，如吞噬荧光微球的方法以及吞噬荧光标记大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和结核分枝杆菌等细菌的方法。其中，吞噬荧光微球的方法中，荧光微球颗粒比较均一，与小鼠血清孵育后，能够使其表面结合免疫球蛋白，有很好的检测效果，但是成本较高。用大肠杆菌等一些细菌用来检测吞噬细胞活性具有以下缺点：第一，细胞较小，很容易被吞噬细胞表面受体所粘附，影响检测结果。第二，利用FITC标记这些细菌，标记率较低，因此在实验中会 产生一定的误差。V.Miliukien 等报道了用流式细胞术技术检测外周血中中性粒细胞吞噬荧光标记啤酒酵母来检测其吞噬活性，但由于其没有把未吞噬的荧光酵母细胞除去，只是利用前向光和侧向光圈住吞噬细胞，由于酵母细胞个体较大，数目远多于粒细胞的个数，因此，在流式细胞仪获取的细胞中含有大量的酵母细胞，使获取的粒细胞数量减少，同时其中混有大量的酵母细胞，也影响了分析结果的准确性；而且，在结果分析中，没有对中性粒细胞吞噬酵母的个数进行定量分析，因此无法计算出粒细胞的吞噬指数。

目前，尚未有利用荧光标记的酵母细胞作为材料来检测腹腔吞噬细胞活性的方法，由于V.Miliukien 的方法中存在上述缺陷，因此，需要在原有利用流式细胞仪检测吞噬细胞活性的基础上探索出一套更加准确、可靠、易行的方法。

发明内容

本发明是为了克服现有利用流式细胞仪检测腹腔吞噬细胞活性技术中的不足之处，提供一种能够消除未吞噬荧光酵母细胞对分析结果的影响，对吞噬细胞吞噬酵母的个数进行定量分析，快速、准确、简单易行的检测吞噬细胞活性的方法。

本发明通过下述技术方案实现：

一种利用流式细胞仪检测腹腔吞噬细胞活性的方法，其特征在于，包括下述步骤：

(1)制备啤酒酵母细胞冻干粉：利用土豆培养基培养啤酒酵母细胞，并将获得的啤酒酵母细胞溶液通过冷冻干燥制成啤酒酵母细胞冻干粉；

(2)利用FITC标记啤酒酵母细胞：将FITC与二甲亚砜按照1mg∶200μl的比例溶解，然后与pH值为9.5、浓度为0.5M的碳酸缓冲液混合配制成浓度为0.1mg/ml的FITC溶液备用；将步骤(1)中得到的啤酒酵母细胞冻干粉与pH值为7.2、浓度为0.01M的PBS缓冲液按20mg∶1ml的比例混匀后，80℃灭活15min；灭活后离心，弃上清液取沉淀；将得到的沉淀物与上述备用的0.1mg/ml的FITC溶液混匀，室温避光孵育1h对啤酒酵母细胞进行荧光标记，其中，0.1mg/ml的FITC溶液的用量为与步骤(1)中得到的啤酒酵母冻干粉的比例为1ml∶20mg；将上述荧光标记后的溶液用pH值为7.2、浓度为0.01M的PBS缓冲液离心洗涤，直至上清液无色透亮；离心，弃上清液取沉淀得到荧光标记的啤酒酵母细胞；检测荧光标记率，调整最终荧光标记率合格的荧光标记啤酒酵母细胞悬液，其荧光标记啤酒酵母细胞浓度为2×10⁹个/ml于4℃冰箱中保存备用；

(3)将步骤(2)中得到的备用的荧光标记啤酒酵母细胞的悬液与小鼠血清按照体积比为1∶1的比例室温孵育60min，用pH值为7.2、浓度为0.01M的PBS缓冲液调整荧光标记啤酒酵母细胞浓度为1×10⁹个/ml；