[发明专利]产河豚毒素的气单胞菌从暗纹东方鲀组织分离、发酵培养和所产河豚毒素的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种从暗纹东方鲀Takifugu fasciatus组织分离产河豚毒素的气单胞菌Aeromonas molluscorum，气单胞菌的发酵培养及所产河豚毒素的检测方法，本发明涉及药用微生物开发和利用的领域，更具体地涉及从细菌中提取河豚毒素，可用作河豚毒素的规模化生产，可为科学研究、医药行业等相关领域提供原料。 

背景技术

河豚毒素(Tetrodotoxin，TTX)，是一种神经毒素，特异性阻断神经细胞细胞膜上的电压门控钠离子通道，可潜在地作为镇痛、麻醉、戒毒、美容等的药品，临床实践证明了TTX对头痛、关节炎、破伤风、霍乱、伤寒、哮喘、百日咳、晚期癌症等多种疾病都有一定疗效目前，河豚毒素的应用还主要局限在科学研究领域。 

虽然河豚毒素的人工合成成功了，但合成成本非常昂贵，目前，人工提取的河豚毒素主要来自于于东方鲀属的河鲀。一方面，目前国内外TTX的提取的原材料全部来源于野生河豚的内脏组织，人工养殖的河豚内脏组织几乎不含TTX或含量极低，仅为野生河豚鱼TTX含量的1％，由于野生河鲀鱼数量有限、且原料昂贵、提取成本也相对较高。因为另一方面，从河鲀中提取河豚毒素，会破坏河鲀鱼的天然资源。因此，有必要从其它生物资源中提取河豚毒素。 

已有很多研究表明河鲀体内的河豚毒素，是来自其体内的某些细菌所分泌的，但细菌分泌的河豚毒素和来自河豚体内的河豚毒素是否完全一样，还没有定论。如果两者是同一物质，那么通过分离筛选产河豚毒素的细菌，再经过微生物发酵技术，就可以大规模的TTX，降低生产成本，也会相应地保护野生河鲀鱼的资源。 

虽然，目前国内已经有从红鳍东方鲀Takifugu obscurus中分离能产河豚毒素细菌的报道，但这些细菌所分泌的产物是否为真正的河豚毒素，还需要更 严格的检测鉴定。目前鉴定从河鲀中提取的河豚毒素的常见方法有小鼠法、高效液相色谱法、质谱法、酶联免疫法等，其中，最可靠的方法是质谱法和酶联免疫法。质谱法可以鉴定分子量，酶联免疫法可以帮助鉴定有相似或相同的分子结构。在目前还不清楚细菌来源的河豚毒素晶体三维结构的情况下，应该需要同时利用高效液相色谱-质谱和酶联免疫法来鉴定细菌来源的河豚毒素，否则，很难确定细菌来源的河豚毒素和河豚来源的河豚毒素是同一物质。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种从野生暗纹东方鲀(Takifugu obscurus)卵巢中分离的能产河豚毒素的气单胞菌Aeromonas molluscorum的方法，包括分离气单胞菌Aeromonas molluscorum所用的方法、气单胞菌Aeromonasmolluscorum发酵培养方法、气单胞菌Aeromonas molluscorum所产河豚毒素的竞争性ELISA检测方法、气单胞菌Aeromonas molluscorum所产河豚毒素的LC-MS检测方法。 

河鲀为暖温带及热带近海底层鱼类，栖息于海洋的中、下层，有少数种类进入淡水江河中，当遇到外敌，腹腔气囊则迅速膨胀，使整个身体呈球状浮上水面，同时皮肤上的小刺竖起，借以自卫。每年3月由外海游至江河口的咸淡水区域产卵。唯有暗纹东方鲀(Takifugu obscurus，英文名：Obscure puffer)一种成群溯河进入淡水，5-6月在江河中有产卵；怀卵量一般在4-5万粒间。秋季水温下降，开始降河，和其它种类一样游向深海区，12月初返回深海区越冬。当年出生的幼鱼在江河或通江的湖泊中生活，到翌年春才回到海里，在海里长大至性成熟后再复进入江河产卵。进入长江的河鲀于4-6月，在中游江段或洞庭湖、鄱阳湖中产卵。河鲀的食性杂，以鱼、蝦、蟹、贝壳类为食，亦食昆虫幼虫、枝角类、桡足类以及高等植物的叶片和丝状藻类。在生殖洄游期间一般很少摄食。 

暗纹东方鲀Takifugu obscurus中分离出能产河豚毒素的细菌Aeromonasmolluscorum的方法，该细菌所产的河豚毒素与河豚来源的河豚毒素一样或非常相似，可用作河豚毒素的商业开发和相关的科学研究。 

产河豚毒素的气单胞菌(Aeromonas molluscorum)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所邮编100101。保藏日期2010年4月23日， 保藏编号CGMCC NO.3760。 

本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现：