[发明专利]导入nodD基因的大豆根瘤菌工程菌株HD-SFH-02的构建方法

权利要求书

1.导入nodD基因的大豆根瘤菌工程菌株HD-SFH-02的构建方法，其特征在于导入nodD基因的大豆根瘤菌工程菌株HD-SFH-02的构建方法按以下步骤进行：一、对快生型大豆根瘤菌15067进行活化和扩培，然后提取基因组DNA；二、采用同源序列克隆法，以快生型大豆根瘤菌15067基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得目的基因nodD，然后采用TaKaRa Agarose GeL DNAPurification Kit进行纯化，再将纯化后的目的基因nodD与TA克隆载体pMD18-T进行连接，获得连接产物；三、将连接产物转化大肠杆菌DH5α及阳性克隆子的筛选与鉴定，然后采用碱裂解法提取质粒载体pUC19，再进行PCR扩增，获得lac启动子，然后lac启动子和质粒载体pET-28a分别经BglII和Nco I进行双酶切，回收所需目的片段，连接并构建重组质粒载体pET-P_lac；四、将目的基因nodD与重组质粒载体pET-P_lac分别经Nco I和Xho I进行双酶切，回收所需目的片段，连接并构建重组载体pET-P_lac-nodD；五、以重组载体pET-P_lac-nodD为模板进行PCR扩增，获得P_lac-nodD-T7片段，然后将P_lac-nodD-T7片段与pTR102质粒载体分别经KpnI进行单酶切，回收所需目的片段，连接并构建重组原核生物表达载体pTR-P_lac-nodD；六、采用三亲本杂交技术将原核生物表达载体pTR-P_lac-nodD转化到大豆土著根瘤菌中，即完成导入nodD基因的大豆根瘤菌工程菌株HD-SFH-02的构建；其中步骤二中PCR扩增所用上游引物为5’-CGGCCATGGGTTTTAAGGG-3’，下游引物为5’-GCGCTCGAGTTGCGGGCTCAAGGGTG-3’；步骤三中PCR扩增所用上游引物为5’-CGCAGATCTAAACGCCTGGTAT-3’，下游引物为5’-GCGCCATGGCTGTTTCCTGTGTG-3’；步骤五中PCR扩增所用上游引物为5’-CGCGGTACCAGATCTAAACGCCTGG-3’，下游引物为5’-CGCGGTACCCAAAAAACCCCTCAAGA-3’。

2.根据权利要求1所述的导入nodD基因的大豆根瘤菌工程菌株HD-SFH-02的构建方法，其特征在于步骤二中PCR扩增的反应体系为20μL反应体系，由下列成分组成：

成分                                               用量

400ng/μL快生型大豆根瘤菌15067基因组DNA            0.5μL

0.2μM 引物P1                      1.0μL

5’-CGGCCATGGGTTTTAAGGG-3’

0.2μM 引物P2                      1.0μL

5’-GCGCTCGAGTTGCGGGCTCAAGGGTG-3’

10×Ex Taq Buffer                  2.0μL

10mmol/L dNTP                      1.5μL

Ex Taq DNA聚合酶                   0.5μL

无菌水                             13.5μL

PCR扩增条件为：94℃变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸90s，共35个循环，再72℃延伸7min，4℃保温。