[发明专利]微型全息式生物传感反应器系统

说明书

技术领域

本发明涉及发酵领域，更具体地涉及一种可用于代谢通量分析的微型全息式生物传感反应器系统及其应用。

背景技术

对于生物产品生产来说，要想提高和改进生产工艺过程，首先必须对微生物胞内的代谢状态有个详细的了解，这方面研究最有力的工具是利用代谢网络通量分析方法，来对细胞的生理状态参数和代谢变化情况进行测定。

代谢通量(metabolic flux)是细胞生理学的一个基本决定因素，也是代谢途径中最重要的参数。代谢通量分析(metabolic flux analysis，MFA)是根据代谢路径中各反应的计量关系以及实验中所测得的数据来确定整个代谢反应网络中代谢通量分布的一种方法，在代谢工程中占有重要地位。通过计算不同途径或不同条件下的代谢通量分布，可以表征细胞的代谢能力，洞察遗传修饰对细胞代谢状态的影响，从而为进一步更加合理的遗传改造提供理论依据。

MFA已经成功应用到了多种生物代谢途径优化中，实现了包括有机酸、维生素、乙醇等多种目的产物产率的提高。MFA经历20多年的迅猛发展，无论在实验方法、测量手段、还是数据分析与评估方面，所涉及的相关技术日趋完善，已经成为代谢工程中一种标准且广泛应用的诊断工具。

传统的MFA是基于物质守恒，利用胞内主要化学反应的化学计量模型及胞内的物料平衡(黑箱模型)计算胞内的代谢通量，因此也称之为计量学MFA(Vallino，J.J.and Stephanopoulos，G.，1993)。计量学MFA的测量参数主要包括底物吸收速率、产物生成速率、生物量的组成及CO₂的释放等(vanGulik，1995；Jin，S.，1997)。然而这种计量学MFA在处理实际问题时显示出很多局限性(Zupke，1994)：首先这种局限性表现在能量平衡分析上，能量平衡分析需要确定细胞中所有涉及辅因子(NADH或NADPH等)和ATP的产生与消耗的反应，由于全面确定与能量相关的反应非常困难，所以由此计算出来的某些通量并不准确；其次，在原核生物中存在大量无效循环，这对计量学MFA处理能量平衡问题带来了更大的困难；再次，计量学MFA不能确定细胞中大量存在的可逆反应、双向反应、回补反应及并行反应中的净通量。而这些途径的存在和通量的大小在产物的合成过程中却起着非常重要的作用(Wolfgang Wiechert，2001)。

近年来，基于计量学MFA的上述局限性，发展了以¹³C标记实验(¹³Clabeling experiments，CLEs)为基础的¹³C代谢通量分析(¹³C-metabolic fluxanalysis，¹³C-MFA)，该方法利用标记的葡萄糖、甘油、氨基酸和甲醇等底物进行标记代谢实验，根据代谢过程中原子的生化途径代谢变化，建立物质碳原子与碳原子之间的映射对应网络矩阵，并根据得到的标记碳原子的质量风度分部信息，对代谢流通量进行计算(Schmidt，K.，1997；Christensen，B.，and Nielsen，J.，1999；Stephanopoulos，G.1999，)。¹³C-MFA最典型的应用是在连续培养过程中使代谢达到拟稳态，利用这时的菌体蛋白组成原氨基酸的标记信息，来对中心代谢通量进行计算。然而，该方法的主要缺点在于：由于这些原蛋白是在整个过程中生成的，所以不能代表代谢过程中某一时刻的代谢流变化，从而不能对瞬时代谢流进行测定分析，只能对于处于对数生长期和连续培养的拟稳态过程进行原蛋白氨基酸的丰度测定，来计算该过程的代谢通量。

近年来，一些研究成果表明，利用胞内游离的氨基酸信息，而不是原蛋白氨基酸的信息来进行代谢通量分析是一种行之有效的方法。在菌体细胞的非生长期，菌体原蛋白氨基酸的更新速率非常慢，但胞内游离氨基酸池的变化速率非常快，所以游离氨基酸的标记丰度信息可以用于胞内瞬时代谢通量的分布信息。Kromer和Wittmann，C.等利用GC-MS通过测定批次培养过程中不同时刻的胞内游离氨基酸的来分析谷氨酸棒杆菌的代谢通量；Wahl(2004年)利用NMR分析了L-Phe生产菌合成过程中的代谢变化；Drysch在2004年利用游离氨基酸信息研究了Lys合成过程通量分析。