[发明专利]肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体融合蛋白及其制备和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物领域，具体涉及肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体融合蛋白及其制备和其在医药领域的应用。

背景技术

肿瘤是一类严重威胁人类健康与生命的疾病，肿瘤的治疗已经成为日益迫切需要解决的重大公共卫生问题。近年来尽管抗肿瘤药物研究已经有了很大的发展，但仍存在着针对性差，对正常细胞也产生杀伤作用等缺陷，使之应用受到很大限制。因此，研制靶向性杀伤肿瘤细胞的基因工程药物仍具有重大的社会效益与经济效益。

1995年，Wiley SR等报道从人表达标签序列文库(EST，expressedsequence tag)中筛选到一种编码抗肿瘤蛋白的基因，该基因编码的蛋白称为肿瘤坏死因子相关凋亡配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)，又称凋亡素2配体(Apo2L)，属于肿瘤坏死因子超家族(Wiley SR，et al.，Immunity 3：673-682，1995)。TRAIL与DR4或DR5受体结合后，DR4和DR5的死亡结构域传导凋亡的信号通过FADD和依赖caspase 8机制在细胞内途径和细胞外途径实现的。TRAIL对于大多数恶性肿瘤有抑制细胞生长和细胞毒效应，而人体的正常细胞则对TRAIL诱导的凋亡耐受(Ashkenazi A，et al.，JClin Invest 104：155-162，1999)。因其特异性地诱导肿瘤细胞发生凋亡，而对正常细胞没有显著细胞毒性的特点，因此TRAIL在肿瘤治疗中具有良好的前景，自发现以来一直被作为肿瘤治疗研究的热点。TRAIL虽然在体内体外实验以及临床实验中均显示了很显著的抑制肿瘤细胞生长的作用，但是半衰期比较短，人体内半衰期仅有40分钟，严重影响了TRAIL蛋白在体内的疗效。

发明内容

本发明的目的是提供一种TRAIL融合蛋白，此种融合蛋白可以显著的增加蛋白稳定性以及延长在动物体内半衰期，显著的提高治疗效果。

本发明提供的TRAIL融合蛋白包括：(1)包含至少二个半胱氨酸的交联区；(2)人源亮氨酸拉链结构域；(3)人源TRAIL蛋白、人源TRAIL蛋白胞外区或人源TRAIL蛋白胞外区的片段。

TRAIL(肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体)是一种在本技术领域内被熟知的蛋白。TRAIL核苷酸序列GenBank登录号NM_003810。TRAIL蛋白的功能是作为死亡受体DR4(TRAIL-RI)和死亡受体DR5(TRAIL-RII)的配体，与其结合诱导凋亡或细胞死亡。人源TRAIL蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，其胞外区是从N端开始的第41位至第281位氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示.

依照本发明，一种TRAIL融合蛋白从N端至C端具有如下序列：(1)交联区，其中包括至少二个半胱氨酸可以形成分子间二硫键；(2)人源亮氨酸拉链序列；(3)根据情况可有一不多于10个氨基酸的连接区；(4)人源TRAIL多肽或其胞外区，可以与死亡受体DR4(TRAIL-RI)或者死亡受体DR5(TRAIL-RII)相结合。

基于本发明的目的，融合蛋白中的人源TRAIL多肽可以是天然TRAIL蛋白全长或者部分片段，长度足以与死亡受体DR4(TRAIL-RI)和死亡受体DR5(TRAIL-RII)结合。优选的是融合蛋白中的TRAIL多肽可以是TRAIL蛋白的胞外区，包含天然人源TRAIL蛋白胞外区的全长或者部分片段。更加优选的是融合蛋白中的TRAIL多肽是一种TRAIL蛋白的可溶性片段，包含TRAIL蛋白胞外区的全长或者部分片段，不含有人源TRAIL蛋白的跨膜区以及胞内区。在一种实施方案中，本发明所述融合蛋白中的人源TRAIL多肽含有如SEQ ID NO：3所示氨基酸序列。

作为优选，所述交联区为不少于3个但不多于30个氨基酸的氨基酸序列，

更优选地，所述交联区含有不多于10个氨基酸的人源氨基酸序列。

在本发明的具体实施例中，其中所述交联区含有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

作为优选，其中所述人源亮氨酸拉链结构域为人c-fos，c-jun，c-myc，max、mdx1或人matrilin蛋白所含有的亮氨酸拉链结构域。

在本发明的具体实施例中，其中所述人源亮氨酸拉链结构域含有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

在一种实施方案中，其中所述TRAIL融合蛋白包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。