[发明专利]同源重组构建双GAL4基因型工业酿酒酵母及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及到基于同源重组技术同时敲除工业酵母染色体特定基因和插入特定基因后的重组酵母菌株，并涉及到应用此菌株作为宿主进行外源蛋白表达后的工业酶的表达产量。

背景技术

酿酒酵母GAL系统的半乳糖-葡萄糖调控是真核生物转录调控系统中研究的最为清楚的一种调控机制。GAL系统包括一系列的结构和调控基因，在酵母生长过程中这些基因在转录水平上通过碳源进行调控，一般被葡萄糖所抑制，被半乳糖所诱导。由于GAL基因表达可以被生长条件所控制，因此GAL基因对外源基因的表达具有很大的应用价值。利用GAL基因的诱导特点可以控制外源蛋白在酿酒酵母中的表达，并提高外源蛋白的表达水平。GAL1、GAL7和GAL10的启动子被大量用来指导外源蛋白在酿酒酵母中的表达。

GAL4是GAL基因诱导表达的主要正调控因子，但GAL4在酵母细胞中拷贝数很低。低拷贝数限制了依赖于GAL4的GAL基因的表达，成了利用GAL启动子表达外源基因的瓶颈。GAL4p表达量低的原因主要是因为其启动子较弱，比强启动子GAL1弱了大约90倍左右。通过基因技术增强酵母GAL4p的表达量从而提高GAL启动子控制下的外源基因的表达水平成了目前重组蛋白表达研究的热点之一。

为了提高GAL4p的表达，可将GAL4基因置于强启动子下方插入多拷贝载体后转化酵母。但由于在多拷贝载体上大量表达GAL4基因会打破其与GAL80p之间的平衡，造成与半乳糖无关的GAL80p的组成型表达并影响GAL启动子的转录，因此反而会导致外源蛋白表达量降低和酵母在半乳糖培养基中生长滞后。为了维持GAL4、GAL80和GAL3之间的平衡，一个能同时表达Gal3p-Gal80p-Gal4p的YEP载体pMEGA2-DURA3被构建，β-半乳糖苷酶作为报告基因。结果表明，pMEGA2-DURA3转化的酵母GAL4p表达量增加了15-20倍，β-半乳糖苷酶的表达量增加12倍，但GAL4的过量表达也引起了酿酒酵母细胞的水解和形态的改变。为了在提高GAL4p表达量的同时避免其过量带来的副作用，Schultz(1987)构建了一个染色体上整合了GAL4结构基因与GAL10启动子表达框的酿酒酵母菌株，并用含有GAL10启动子和外源基因的质粒转化酵母。GAL4蛋白在此重组酵母中得到大量表达，从而使得外源gp350基因的表达是非转化菌株的10倍。

从以上研究结果可知，为了最大限度的利用GAL4蛋白促进GAL基因转录的能力，必须增加GAL4蛋白的表达量，同时不影响酵母的生长和发酵性能。此外，尽管GAL启动子诱导下的外源蛋白能够达到较高的表达水平，然而，使用半乳糖做为GAL1启动子的诱导剂也存在缺陷。GAL1启动子的诱导需要半乳糖，而半乳糖在酵母生长过程中会被酵母同步消耗，造成诱导剂浓度下降，随之影响外源蛋白的表达。此外，一般情况下半乳糖被添加到培养基中的终浓度为2％-4％，与葡萄糖相比半乳糖价格较为昂贵，使得工业化大规模发酵中半乳糖浓度的维持需要较高的经济成本。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一株双GAL4基因型工业酿酒酵母菌株，在GAL4基因引入酵母染色体的同时敲除酵母的一个GAL1基因，从而构建获得GAL1基因部分缺失酵母菌株，该菌株能降低工业生产中酵母对半乳糖的消耗量，并通过GAL4基因的引入进一步提高该酵母对GAL启动子控制下的外源蛋白的表达产量。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种同源重组构建双GAL4基因型工业酿酒酵母，保藏名称为：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S.C DG115，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2009年9月6日，保藏号：CGMCC NO.3262。

作为本发明的同源重组构建双GAL4基因型工业酿酒酵母的改进：染色体上的一个GAL1基因被敲除，同时在敲除位点处引入了一个GAL4基因拷贝。

本发明还同时提供上述同源重组构建双GAL4基因型工业酿酒酵母的用途，作为宿主进行外源蛋白表达。其表达量能提高3倍以上，对半乳糖的利用半衰期延长。

本发明通过GAL4基因的引入进一步提高酵母对GAL启动子控制下的外源蛋白的表达产量。

本发明的具体步骤如下：

1.扩增所需基因片段并克隆到载体中；

2.设计同源重组引物，以步骤1中的重组载体为模板进行PCR扩增，得到上下游与酵母GAL1基因有部分同源序列的包含GAL4基因和抗性表达盒的基因片段；