[发明专利]一种适于流式细胞分析的果树成熟叶片细胞核提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞核提取方法，具体地说，涉及一种适于流式细胞分析的果树成熟叶片细胞核提取方法。属于细胞生物学领域。

背景技术

流式细胞术(flow cytometry，FCM)是利用流式细胞仪(flowcytometer)分析测定细胞核DNA含量的方法。流式细胞仪是进行流式细胞分析的仪器，它集电子技术、计算机技术、激光技术、流体理论于一体，是一种非常先进的检测分析仪器，被誉为实验室的“CT”。该技术可对处于快速流动中的微小生物颗粒(细胞、细胞核、染色体等)进行多参数、快速定量分析和分选。在植物遗传和育种研究中，则可用于植物倍性鉴定、细胞核DNA数量(基因组大小)测定、生殖途径鉴定等。但是，由于植物细胞核的悬液制备困难，致使该技术在植物细胞生物学中的应用较为滞后。

利用流式细胞仪可快速准确地鉴定各种植物的倍性，但分析鉴定的结果受到待检样品细胞核提取的浓度和纯度影响，如果样品核悬液中细胞核的浓度太低，则在分析图中出现的峰会很低，令结果无法判断；如果样品核悬液中杂质较多，分析图中出现的峰较宽，杂质峰高，同样无法准确判断结果，因此待检样品细胞核提取的浓度和纯度决定流式细胞仪分析结果的可靠性。

在已报道的研究中，普遍要求植物材料必须是嫩叶或幼嫩的茎尖组织，所以目前国内外在进行流式分析时样品的选择都以幼嫩组织为好，是因为其可以避免老组织内含有较高浓度的淀粉、多糖、磷酸钙和其他一些新陈代谢之类的粘性物质，而这些物质分布在细胞质中，使得细胞质紧密地和细胞核粘在一起，影响了细胞核的纯度，这些物质同时也加速了细胞核的老化，增加了样品的粘度，阻碍了流式细胞仪中鞘液的流动，使得其不能准确地检测出待测样品的倍性，因此流式细胞仪分析的准确性与植物细胞核提取方法有直接关系。

由于粘度过高的植物材料，材料状态、取材部位和细胞核提取方法直接影响流式细胞仪的检测结果，目前基本上采取选择新鲜、幼嫩的植物材料并通过提取方法的改进来消除材料本身的粘性。李赟(1998)等苹果、草莓采取的是试管苗嫩茎或幼叶；刘庆忠(2001)等人用离体苹果新梢叶片，测定样品单个细胞核的DNA总量；刘继红(2003)以二倍体粗柠檬幼嫩叶片为材料，尽管朱道圩(2007)为了防止中华称猴桃叶中酚类和粘性物质的干扰，在前人工作基础上，修改和优化了细胞核提取液配方和提取方法，仍然采用的是猕猴桃不定芽苗顶部叶片。

目前报道的实验方法局限于采用幼叶或其他幼嫩组织，发明人也利用前人的缓冲液和提取方法来准备细胞核悬液，用流式细胞仪分析苹果、葡萄、草莓和菠萝等的试管苗和幼嫩叶片，取得了很好的检测效果。但在分析田间苹果样品或细胞内黏性过高的样品时，测定效果较差，而且容易堵塞仪器管道。在我们收到外单位送检的样品中，85％都是较老的田间材料，以成熟叶片居多。选择新鲜、幼嫩的材料在果树生产、育种中仅仅局限于初春刚萌发的叶片和试管苗，因此利用流式细胞仪进行分析受到极大的限制。

由此针对这些问题并借助前人的经验，发明人进行了细胞核提取液配方优化和提取方法的改进，旨在延长流式细胞分析周期，提高DNA分辨率，增加样品检测的准确性和成功率，降低核悬液中杂质的浓度，减少杂质对流式细胞分析的影响，并且在分析的过程中，不会堵塞仪器管道，有利于流式细胞仪的保养。

发明内容

本发明的目的是提供一种适于流式细胞分析的果树成熟叶片的细胞核提取方法，该方法可延长流式细胞分析周期，提高DNA分辨率，增加样品检测的准确性和成功率，降低核悬液中杂质的浓度，减少杂质对流式细胞分析的影响，并且在分析的过程中，不会堵塞仪器管道，有利于流式细胞仪的保养。

为了实现本发明目的，本发明提供一种适于流式细胞分析的果树成熟叶片的细胞核提取方法，其所用的细胞核提取液组分为：

15-20mmol/L Tris，40-60mmol/L的KCl，10-20mmol/L的NaCl，2-5mmol/L的Na₂EDTA，10-20mmol/L MgSO₄，40-50mmol/L蔗糖和0.5-1.0％(v/v)Triton X-100，加ddH₂O(去离子水)至200ml，调pH为7.5-8后，加入200μl的15mmol/L巯基乙醇。

本发明所述细胞核提取方法中所用的染色缓冲液为在细胞核提取液中加入20mg/L的RNA酶A和20mg/L PI(碘化丙啶)(即1L细胞核提取液中加入20mg的RNA酶A和20mg PI)。

本发明所述细胞核提取方法，其包括如下步骤：