[发明专利]一种ABO血型基因分型的PCR-SBT方法及试剂

说明书

技术领域

本发明涉及基因分型检测方法，尤其涉及一种用于ABO血型基因分型的分子生物学检测方法，本发明还涉及该方法所应用的试剂。

背景技术

人类ABO基因位于9号染色体(9q34.1～34.2)，由A、B和O三个复等位基因控制，包含长度大小从28～688bp不等的7个外显子和长度约为19514bp的6个内含子，总长大约为18～20kb。其基因编码产物是糖基转移酶，多数编码序列(1062bp中823bp)位于第6和第7外显子上，负责编码糖基转移酶的催化区域。这些转移酶控制ABO血型抗原的生物合成，从而决定其血型。ABO血型的其它等位基因DNA序列高度保守，与A101的DNA序列紧密相关，仅有几个碱基替换或单个碱基缺失。对汉族人群中ABO血型进行频率调查发现，主要为A102、B101、O01、O02这几种等位基因。A102等位基因与A101等位基因相比只是在467位的单个碱基替换(C/T，Pro/Leu)，两者翻译的糖基转移酶活力没有显著性差异。B101基因仅在297、526、657、703、796、803、930和1096位碱基8个位置与A101有改变，导致糖基转移酶多肽链上有4个氨基酸替代：C526G(Arg/Gly)、G703A(Gly/Ser)、C796A(Leu/Met)、G803C(Gly/Ala)。O01等位基因与A101的差异是第261位核苷酸G缺失，引起了阅读框移动，在351至354位置产生终止密码子，肽链合成在117位氨基酸终止，产生一条无催化能力的短肽链。除此之外，人群中还存在大量的亚型和罕见基因型，通常也是由于单个核苷酸变异形成的。

现有技术中，人类ABO血型检测方法主要有两种：一是经典的血清学方法，二是基因分型方法。血清学方法具有简单实用等特点，但也存在一定的局限性，首先需要新鲜红细胞样品，对样本要求较高；其次方法检测的范围较窄，只能对ABO血型中的常见血型进行定型，对于一些亚型标本以及罕见样本，在血型检测时易出现正反定型不符，难以定型或定型错误的现象，且不能确定其具体基因型。基因分型的方法在某种程度上弥补了经典血清学方法在这方面的不足。

目前的ABO血型基因分型最主要的方法是PCR-SSP(PCR-序列特异性引物)，但该方法需要进行多管扩增，需有进一步改进的基因扫描技术可进行单一管扩增。并且PCR-SSP方法在设计引物时只能针对某些具有区别性的特异性位点进行设计，因此只能对常规的ABO血型进行基因分型，对于一些特殊的亚型或存在的新突变位点则难以明确。而ABO血型PCR-SBT(PCR-Sequence based typing，基于PCR测序的分型技术)分型方法可以克服前两者的上述缺陷和局限性。但现阶段的ABO血型PCR-SBT分型方法主要针对多态性位点比较集中的6、7号外显子的测定来确定其基因型，而对第1-5号外显子不进行测序，尤其是含有起始密码子的1号外显子，其GC含量比较高，PCR扩增较难获得，这种操作方法存在两个缺陷：第一，由于6、7号外显子单核苷酸多态性非常集中，而各个ABO血型之间的差异可能仅有单个或几个核苷酸的变异所引起，容易造成SNP位点(单核苷酸多态性位点)的漏检，引起血型基因型的误判。第二，第1-5号外显子以及所包含的内含子中同样存在大量的基因信息，对确定样本基因型和解决ABO血型相关问题具有重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种用于ABO血型分型的PCR-SBT方法，以克服现有血型分型技术中的上述缺陷。为此，本发明采用以下技术方案：

它包括下述步骤：

(1)制备人基因组DNA；

(2)设计扩增引物，用聚合酶链反应分别扩增人基因组DNA中ABO基因外显子1、外显子2-4、外显子5-7的三个片段，其中1号外显子采用含GC缓冲液的PCR扩增；

(3)将步骤(2)得到的扩增产物进行双酶切纯化；

(4)设计测序引物，将步骤(3)得到的纯化产物进行测序PCR反应；

(5)将步骤(4)得到的测序产物进行醋酸钠-乙醇沉淀法纯化，进行毛细管电泳测序；

(6)将步骤(5)获得的序列通过软件分析，确定其基因型。

本发明另一个所要解决的技术问题是提供上述方法所用的试剂。为此，本发明采用以下技术方案：它包括3对寡核苷酸扩增引物和18条寡核苷酸测序引物，所述3对寡核苷酸扩增引物分别扩增ABO血型基因的1号外显子、2-4号外显子以及5-7号外显子，所述18条寡核苷酸测序引物用于测序分析。

所述3对寡核苷酸扩增引物序列如下：

1号外显子扩增引物：