[发明专利]一种利用DNA序列条码矫正二代高通量测序的序列丰度偏差的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种利用DNA序列条码矫正二代高通量测序的序列丰度偏差的方法。

背景技术：

高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能。

二代高通量测序技术的发展，以454公司2005年底，推出的创新性的基于焦磷酸测序法和emulsion PCR的超高通量基因组测序系统Genome Sequencer20 System(1)为起始。2007年又454公司推出了性能更优的第二代基因组测序系统：Genome Sequencer FLX System。目前，已实现市场商业化的二代高通量测序技术平台，除了454的GS系统外，还包括SOLiD(ABI公司)(2)，Solexa(Illumina公司)(3)，Helicos和Polonater(4)。二代高通量测序不仅可用于DNA分子的序列测定，而且也可以通过测定不同DNA分子的丰度对转录组水平进行研究，从而有望在未来替代芯片技术。但这几种高通量测序技术平台中，除了Helicos的单分子测序和Solexa使用bridge-PCR技术外，其余都采用emulsion PCR技术对单分子DNA模板进行扩增放大。emulsion PCR技术，即利用油水混合震荡产生的油包水小球中单一DNA模板进行PCR扩增和测序的。emulsion PCR技术的一个重大缺陷，是在PCR反应的过程中不可避免的发生油包水小球破裂，而污染其他的空白小球，从而造成错误地提高破裂小球中DNA模板序列读出的丰度，从而限制了二代高通量测序仪用于DNA分子丰度的研究。emulsion PCR的污染问题，是几种二代高通量测序技术平台的共有问题，矫正污染所带来的数据偏差，将为二代高通量测序技术平台在科研和临床应用破除一个严重的障碍，为二代高通量测序技术的应用开辟更广阔的前景。

发明内容：

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种一种利用DNA序列条码矫正二代高通量测序的序列丰度偏差的方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种利用DNA序列条码矫正二代高通量测序的序列丰度偏差的方法，其特征是：采用

方式一：将10个核酸序列组成的序列条码(用N代表)加到454建库adaptor的下游直接与样本DNA相连的部分(其中字体加粗的部分为序列互补部分)

5′-CCATCTATCCCTGCGTGCTCAT

3′-ATAGGGACACACGGACCTA或者，

方式二：将10个核酸序列组成的序列条码(用N代表)通过2个PCR引物加到测序样品的一端，核酸序列条码通过最后一轮PCR引入

5’-NNNNNNNNNN-与样本序列上游互补的特异序列-3’

5’-NNNNNNNNNN-与样本序列下游互补的特异序列-3’，或者，

方式三：将高通量测序引导序列和10(5×2)个核酸序列条码(用N代表)通过PCR加到测序样品的两端(每端5个核酸条码序列)，核酸序列条码通过最后一轮PCR引入

#PA：5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG-N5-与样本序列上游互补的特异序列

#PB：5’-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAG-N5-与样本序列下游互补的特异序列，

上述三种方式DNA序列条码对不同样品DNA通过测序平台高通量测序获得的丰度数据进行矫正。

上述三种方式的适应条件和流程如以下：

方式一：

主要应用于多种不知序列DNA混合片段，通过DNA接头与DNA样本的连接(ligation)反应来引入核酸序列条码。DNA样本片段利用nebulization的方法打断后，使用Agencourt的AMPure XP试剂提取400-800bp的DNA片段。经过末端修复后，利用Klenow polymerase酶和dATP加入3’A-tail。然后对3’A-tailed DNA样品和有酸序列条码的DNA接头连接(ligation)。此种设计方法的产物，可直接进入454的高通量测序的emPCR步骤。

方式二：

主要应用于已知序列的单一或几种DNA混合片段(特别是PCR产物或病毒DNA)。它利用与样本序列互补的特异序列作为引物，通过一轮的PCR反应来引入核酸序列条码。为了提高核酸序列条码的引入效率，将使用较长的annealing时间。此种设计的引入核酸序列条码后产物，还要通过建库步骤才能进入454的高通量测序的emPCR步骤。

方式三：