[发明专利]一种酰胺水解酶的高效表达及应用

权利要求书

1.一种包括酰胺水解酶基因(DAM基因)的核苷酸序列的表达载体，其中DAM基因的核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.1所示的碱基序列。

2.权利要求1所述的表达载体的构建方法，包括如下步骤：

1)获取含有DAM基因的Delftia tsuruhatensis(CCTCCNo.M205114)的基因组DNA；

2)根据R-型异构体立体选择性酰胺水解酶基因的核苷酸序列设计引物A和引物B；

3)以Delftia tsuruhatensis基因组DNA为摸板，加入引物A、引物B、Taq DNA聚合酶以及dNTP混合物进行PCR扩增；

4)PCR产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳后，采用DNA胶回收试剂盒回收1.4kb大小的PCR扩增片断(DAM基因)；

5)将PCR扩增到的DAM基因与克隆载体pUC118连接，形成克隆载体pUC118-DAM；

6)pUC118-DAM和表达载体分别用限制性内切酶消化，形成互补的粘性末端，经T4 DNA连接酶连接，形成含DAM基因的表达载体。

3.根据权利要求2所述的表达载体的构建方法，其中第6步所述的表达载体选自质粒、粘粒或噬菌体。

4.权利要求3所述的表达载体的构建方法，其中质粒选自pUC，pBluescript(Stratagene)，pET(Novagen Inc.，Madison，Wis.)，pQE(Qiagen)，pSE420或pLEX(Invitrogen)，但不仅限于这些质粒。

5.根据权利要求3-4任一项所述的表达载体的构建方法，其中所述质粒为pET。

6.根据权利要求3-5任一项所述的表达载体的构建方法，其中所述质粒为pET24a(+)。

7.根据权利要求4-6任一项所述的表达载体的构建方法，其中表达载体上的操纵子可选自乳糖操纵子、半乳糖操纵子、或色氨酸操纵子，其中优选LacI操纵子。

8.根据权利要求4-6任一项所述的表达载体的构建方法，其中载体上的启动子可用λpL启动子、Tet启动子、和T7启动子，其中优选T7启动子。

9.一种用于表达DAM基因工程菌株，其特征是是将权利要求1所述的表达载体转化到宿主微生物中得到基因工程菌株。

10.根据权利要求9所述的基因工程菌株，其特征是宿主微生物为大肠杆菌。

11.根据权利要求9-10任一项所述的基因工程菌株，其特征是该基因工程菌株为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)/pET24a(+)-DAM。

12.一种制备具有R-型异构体立体选择性的重组酰胺水解酶的方法，其特征在于用权利要求9-11任一项所述的基因工程菌在诱导剂条件下发酵来生产重组R-型选择性酰胺水解酶。

13.根据权利权利要求12的酰胺水解酶的制备方法，其中诱导剂选自IPTG或α-乳糖；发酵、诱导温度范围控制在20-42℃之间；培养模式可选自批发酵培养或流加培养；培养基选自蛋白胨、酵母粉、氯化钠或其它基础盐培养基。

14.根据权利要求12-13任一项的方法制备得到的重组酰胺水解酶。

15.根据权利要求14所述的重组酰胺水解酶，所述重组酰胺水解酶选自a)由SEQ ID No.2所述的氨基酸序列组成的蛋白质；或b)具有与SEQ ID No.2所述的氨基酸序列至少有80％同源性的氨基酸序列组成的蛋白质；或c)在SEQ ID No.2所述的氨基酸序列前端或后端加上一段SEQ ID No.3所述的氨基酸序列组成的蛋白质。

16.根据权利要求12-13任一项的方法所得到的酰胺水解酶用于水解酰胺类化合物的用途。

17.根据权利要求16所述的用途，所述酰胺类化合物选自(R，S)-型酰胺类化合物或手性酰胺类化合物。

18.根据权利要求17所述的用途，其中(R，S)-型酰胺类化合物选自R/S-2，2-二甲基环丙甲酰胺。