[发明专利]一种简单快速适用于细菌PCR检测样品的前处理方法

说明书

技术领域

本发明涉及对细菌的PCR检测，尤其适用于PCR检测的前处理，其方法既简便又快速。

背景技术

随着分子生物学的发展，PCR方法被用于临床检测与传统的微生物形态学、生化反应和血清学方法的鉴定相比，其方法简单快速、特异、敏感，在合适的条件下，往往几个菌就能被检测出来。但在实际应用中由于临床样品中含有大量抑制PCR反应的复杂成分，限制了其方法普遍应用。一般的检测程序通常大多是首先采用感染样品进行增菌培养，然后划板分离得到纯化菌再培养后进行初步鉴定，其中包括形态学比如菌落形态、染色等鉴定，有时还需要生化和血清学鉴定相配合，步骤繁琐，费时费力，从而大大限制了后续的PCR检测的实际应用。

目前也有研究报道，有途径拓展PCR的应用问题。例如：中国农业大学食品科学与营养工程学院许文涛等在2009年17(4)的《农业生物技术学报》发表的题为《稻种PCR抑制因子的3种去除方法》论文中披露了3种去除这些抑制物质的方法，即DNA样品稀释法，硅膜纯化基因组法和低熔点琼脂糖纯化法；其中DNA样品稀释法去除抑制因子最简便快捷等。另外还有北京军事医学院疾病预防控制所传染病控制中心赵红庆等在2007年18(5)《生物技术通讯》发表的题为《多重PCR技术在病原检测中的应用》综述了多重PCR在细菌病原体的检测，病毒病原体的检测，支原体衣原体及寄生虫的检测，微生物耐药性检测等方面的应用。又如在样本检测中，采用试剂盒能够从粪便标本中提取DNA并有效去除抑制物，如天根公司的QIAamp DNA Stool Mini Kit，该试剂盒使用硅胶膜技术，可以从新鲜或冷冻人粪便及其他带有高浓度PCR抑制物的样品中纯化DNA。但毕竟需要购买试剂盒，使成本大大增加，从而也限制了PCR检测的实际应用。尤其外对粪便样本的处理方法较多，有浮力密度离心过滤法、两步过滤法、核酸吸附矩阵法、金属氢氧化物吸附法、酚抽提法等，都是相对比较繁琐的处理方法。另山东省农科院奶牛研究中心马广强等人在2006年22期(2)153页《中国人兽共患病杂志》发表的“直接从粪便中检测致牛犊腹泻产肠毒素大肠杆菌的双重PCR方法的建立与应用》披露依据肠毒素大肠杆菌产生的毒素基因序列，设计了两种引物，建立多重PCR方法。本发明与此对照，目的都是去除抑制物，但是盲菌培养与针对引物的扩菌培养有独到之处。简单快速的前处理方法，可有效的去除标本中的PCR抑制物，消除临床标本对PCR反应的抑制作用，避免假阴性结果出现。将为拓展PCR检测的应用，产生了极强的实用效果。

发明内容

本发明的目的在于：提供适用于PCR检测的样品的前处理方法，即简单又易行，能使PCR检测方法在临床样品的应用中既简便又快速，拓展其方法的实用价值。

本发明的目的是这样实现的：一种简单快速适用于细菌PCR检测样品的前处理方法，在无菌操作下取需量的病变组织、分泌物或粪便的临床样本，接种于增菌培养液中，在37℃下恒温培养12-16小时；无菌条件下取需量的培养液，再次接种于同种增菌液中，振荡培养4-6小时；取1-2ml菌液离心，转速为5000转/min，5-6分钟得到菌体沉淀；用双蒸水洗涤菌体2-3遍后，加入100ul无菌双蒸水悬浮，在100℃下煮沸约10-12分钟，离心，转速为12000转/min，3-4分钟得上清液，即为菌粗制DNA，再进行后续的PCR分型检测即可。

所述的PCR检测的前处理方法，实验检测中作为阳性对照的标准(或参考)菌株均购自中国菌种保藏中心。

所述的PCR检测的前处理方法，选用的实验材料均为市售产品。

本发明构思的样本的前处理方法关键是使待检细菌模板拷贝数进一步增加的同时去除了临床样本增菌培养时带入的影响后续PCR反应的抑制成分。但由于样品中PCR抑制物的存在，必须摸索DNA浓度在相对的稀释度内方能检测的条件，避免样本中抑制物干扰的不确定性及假阴性的结果产生。

本方法通过无菌操作取少许临床样本在增菌培养液中预培养细菌，达到增菌的目的，然后取少许培养后的增菌液进行再一次接种以重复培养，达到富集细菌同时去除样本中其他成分的目的。最后按常规操作收集菌体，进行后续的PCR检测，结果表明，得到的菌体DNA足以达到PCR扩增要求，即获得扩增结果，从而达到检测的目的。