[发明专利]小鼠IL-15亚型蛋白的制备及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种小鼠单抗蛋白的制备，特别涉及一种小鼠IL-15亚型蛋白的制备及其应用。

背景技术

IL-15mRNA(interleukin 15，IL-15)广泛表达于各种组织中，包括胎盘、骨骼肌、肾脏、心脏、肺、脑、肠上皮，并同样表达于髓系的造血干细胞中比如巨噬细胞、树突状细胞。IL-15在结构上与白细胞介素2(interleukin 2，IL-2)有同源性，IL-15受体由具有高亲和力的IL-15受体a链、IL-2/15受体β链以及公共链γ链组成，因此IL-15具有一些和IL-2相近的功能，比如刺激T细胞活化和增殖，增强NK细胞杀伤活性并促进B细胞产生免疫球蛋白。最近研究发现IL-15在NK细胞、NKT细胞以及肠上皮细胞的分化、增殖、活化过程中发挥了重要作用，IL-15与IL-17对CD8记忆性T细胞的稳态调节非常重要。研究还证明IL-15通过一种特殊的“反递呈”机制来调控CD8记忆性T细胞的增殖和NK细胞的生存周期，即一种表达IL-15a链受体的细胞能够将IL-15递呈给表达IL-15β链和γ链的细胞。更多的研究表明IL-15是一种有广泛生物学功能的功能强大的细胞因子，除了对免疫系统有着重要的调节作用，在非免疫系统中也同样重要，比如对骨骼肌合成代谢也发挥重要调节作用。

由于IL-15具有强大的免疫调节功能，并对多种器官具有潜在的调节作用，因此其在体内的表达在多个水平受到严格控制。人和小鼠的IL-15基因5′调控区均包含干扰素反应因子元件(IRF-E)及NF-κB结合位点用于上调IL-15mRNA的表达。IL-15基因的调控主要发生在转录后水平，IL-15mRNA的5′UTR区域存在的多个起始密码子(小鼠为5个AUGs，人类为12个AUGs)阻碍了IL-15蛋白的有效翻译，IL-15mRNA的3′UTR区域的调控序列同样能阻止IL-15蛋白的分泌。选择性剪切也同样参与了对IL-15基因表达的调控。

早期研究发现的三种IL-15亚型编码相同的成熟蛋白，但是其信号肽之间存在区别：由48aa组成的长信号肽(LSP)从3号外显子中编码区内的真正的起始密码子开始表达，而短信号肽(SSP，小鼠为26aa，人类为21aa)则由一个新产生的5号外显子中的起始密码子开始表达终止于非成熟的终止密码子。这些不同的信号肽将IL-15蛋白运输至胞外不同的位置。短信号肽IL-15亚型，蛋白翻译效率很高，但是很难分泌；而长信号肽IL-15亚型，蛋白翻译效率较低，但是能直接被运输至高尔基体并分泌。由于IL-15主要通过IL-15Ra的反式递呈发挥功能，共调节IL-15及IL-15R有可能会促使IL-15产生多种功能活性。近期于小鼠小肠上皮细胞发现的两种新的IL-15亚型，与正常的IL-15mRNA相比，分别缺少6号外显子及7号外显子的一部分，直接导致其编码的成熟蛋白与正常IL-15蛋白有区别，研究证明其信号肽均为LSP。这两种编码成熟蛋白改变的IL-15亚型提示IL15/IL-15-R体系比目前所已知的可能更为复杂。

关于小鼠IL-15亚型蛋白的制备及应用，经查新国外仅有美国康涅狄格州健康中心X Tan和L Lefranc，ois在小肠上皮细胞中发现并命名该亚型为ΔE6IL-15。小鼠小肠上皮细胞中该亚型是在免疫体系处于常态下发现的，而未见在免疫体系处于激发态下制备IL-15亚型蛋白的报道。本发明首次于小鼠脾细胞处于免疫激活状态下发现该种亚型，提示该种亚型蛋白可能在免疫体系的负反馈调节中发挥重要的作用。

发明内容

发明目的

本发明目的为制备在免疫体系处于激发态下制备IL-15亚型蛋白，通过体外实验检测其对正常IL-15蛋白的拮抗作用，提供该亚型蛋白在自身免疫性疾病等临床治疗中的应用。

技术方案

为达到上述目的，本发明具体技术方案是，制备有功能活性的小鼠IL-15亚型蛋白，其制备方法包括以下步骤：

(1)扩增IL-15亚型基因片段：取C57BL/6小鼠脾脏，制备脾细胞悬液，使用0.1μg/ml-100μg/m LPS作用24h-48h刺激小鼠脾细胞，获得刺激后的C57BL/6小鼠脾细胞悬液，通过Trizol-氯仿法抽提总RNA。根据NCBI所公布小鼠IL-15cDNA序列(NM008357.1)及pET43.1原核表达载体的结构设计特异性引物，见Seq NO.1和SeqNO.2，经逆转录-PCR常规操作扩增获得小鼠IL-15目的片段。