[发明专利]一种食蟹猴精液冷冻方法

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，具体是一种食蟹猴精液冷冻方法。

背景技术

至今并未发现有与本发明相同或相似的报导。

发明内容

本发明的目的是提供一种食蟹猴精液冷冻方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种食蟹猴精液冷冻方法，精液样品要求新鲜精液活力≥0.7，冷冻方法按以下操作步骤进行：

1.食蟹猴精液冷冻稀释液配方与稀释液的配制

1)冷冻稀释液配方

冷冻稀释液由葡萄糖111.0mmol/L、TES 52.3mmol/L、Tris 16.5mmol/L、蔗糖5.8mmol/L、乳糖58.4mmol/L、体积浓度为20％的卵黄、体积浓度为5％的甘油、青霉素10 000 0IU和硫酸链霉素50000IU组成；

2)稀释液的配制

准确称量1)配方的药品至事先经过灭菌过的平底烧瓶中；准备新鲜鸡蛋1～2只，鸡蛋壳、镊子、手先用75％的酒精消毒，待酒精干后用消毒好的镊子轻轻敲开鸡蛋气室面，倒掉蛋清，抽取所需卵黄量，置于事先消毒好的离心管中，然后放到离心机中离心，按体积浓度为20％抽取卵黄上清液放到平底烧瓶中；最后用去离子水定容1L，混匀后用NaOH或HCl调节稀释液pH至7.0～7.2，置于4℃冰箱中待用；

2.精液稀释

1)精液一次稀释

食蟹猴精液一经采出来后，马上用不含甘油的稀释液作10～20倍的稀释，然后快速将精液运送回实验室；

2)精液二次稀释

一次稀释好的精液送回实验室后，一边轻轻地摇晃精液一边缓慢的滴进甘油，使最终甘油浓度为5％(v/v)，稀释后的精子活力不应低于0.70；

3.精液分装

取出麦管，放在紫外线下照射15min消毒，用专用的精液分装器把稀释好的精液吸到麦管中，不要吸得太满，预留0.5～1.0cm长的空气段，吸好后用酒精灯封口；

4.精液平衡

把分装好的精液用4～6层纱布包裹后放置4℃冰箱中平衡0.5h；

5.精液冷冻

打开冷冻程序仪，设定冷冻程序：4℃～2℃，-1℃/min；2℃～2℃，5min；2℃～-90℃，-8℃/min；把液氮慢慢倒进冷冻程序仪液氮瓶中，运行程序，当运行到5℃时，投入平衡好的精液麦管，让冷冻程序自动运行；当程序运行结束后马上投入液氮中，在-196℃条件下贮存；

6.冷冻精液的解冻

打开恒温水浴锅，把温度升至37℃，把冷冻麦管投入轻轻搅拌解冻，解冻复苏后，取少量精液检查精子的活力，重复检查两次结果取平均值。

本发明的优点是：利用本发明技术，食蟹猴精液冷冻解冻中，精子冷冻解冻后活率和复苏率分别达到45％和62％，可以充分发挥优良雄性食蟹猴的繁殖效率，也可以保存优良食蟹猴的遗传基因，同时为其他珍惜濒危灵长类动物精子冷冻保存研究提供经验借鉴。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述。

实施例

1.精子冷冻保存与解冻复苏

稀释后的新鲜精液经过精子图像分析仪分析，检出精子活力≥70％的新鲜精液用于本研究。合格的新鲜精液用0.25ml麦管分装后放入4℃冰箱中平衡不同时间。用程序降温仪降温，结束后马上投入液氮中(-196℃)贮存。解冻时将麦管从液氮中迅速取出，直接投入37℃水浴中迅速搅动使精子解冻复苏。

2.精子功能的检测

1)精子运动度的检测新鲜精液稀释后以及解冻复苏后，取5μl精液置于37℃预热的Makler精子计数板上，利用精子图像分析仪(CASA)检查精子的活力，重复检查2次，结果取平均值。

2)精子质膜完整性的检测

伊红Y水实验法：10μl精液与40μl 1g/L伊红Y水溶液于载玻片上混匀，覆盖玻片，静置1～2min，显微镜下(×400)观察精子肿胀弯曲情况，计数200个精子，算出肿胀弯曲率。

计算公式：肿胀弯曲率(％)＝(弯曲肿胀精子数/总精子)×100％。

3)精子顶体完整率检查