[发明专利]一种猪传染性胃肠炎、流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体的制备方法

权利要求书

1.一种猪传染性胃肠炎、流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体的制备方法，猪传染性胃肠炎病毒用猪肾细胞传代细胞培养，猪流行性腹泻病毒用非洲绿猴肾细胞传代细胞进行培养，将这两种病毒以体积比(1～3)∶(1～3)的比例混合后与油佐剂以1∶2体积比乳化后作为免疫原，免疫非免疫产蛋鸡，从其蛋黄中提取猪传染性胃肠炎、流行性腹泻病毒蛋黄抗体。

2.根据权利要求1所述的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)TGEV抗原的制备

将传染性胃肠炎病毒液接种在PK15单层细胞上，同时设立细胞对照，37℃ CO₂培养箱中培养，24h后倒掉维持液进行换液，逐日观察细胞病变，若72h后感染细胞病变不明显，则收获细胞悬液冻融后离心分离，取上层清液继续在细胞上盲传，盲传至第二代出现细胞病变，至75％细胞出现细胞病变时收毒，冻融，离心分离，除去细胞碎片，收集上层清液，浓缩后用作抗原；

(2)PEDV抗原的制备

将流行性腹泻病毒液接种于Vero细胞单层上，同时设立细胞对照，37℃ CO₂培养箱中培养，逐日观察细胞病变，若72h后感染细胞病变不明显，则收获细胞悬液冻融后离心分离，取上层清液继续在细胞上盲传，盲传至第三代出现细胞病变，至75％细胞出现细胞病变时，收获细胞悬液，冻融后离心分离，收集上清液，浓缩后用作抗原；

(3)蛋黄抗体的制备

将TGEV和PEDV抗原以1∶1的比例混合，灭活24h后，作为首免用免疫原；取适量的TGEV和PEDV抗原以1∶1的比例混合，灭活24h后，与2倍量的油佐剂乳化，作为二免、三免和四免用免疫原；用上述制备的免疫原对非免疫产蛋鸡进行免疫，另设不免疫的空白对照组；二免后1周开始每隔3天抽样测定高免鸡蛋蛋黄中抗TGEV、PEDV特异抗体效价；若抗体效价达到1∶8以上即可集蛋，收集蛋黄；充分搅拌使蛋黄呈均匀膏状，加入等体积经灭菌并冷却的蒸馏水，搅拌混匀，灭活；然后先在隔层反应罐中加入相当于原蛋黄6倍体积的pH值为4.2的灭菌蒸馏水，并降温至1～4℃，然后将灭活的蛋黄液加入，边加边搅拌，4～8℃静置4h；离心分离上清液并转入另一反应罐中，按总量的0.2％加入辛酸，搅拌均匀，室温放置2～4h；用滤布过滤后，再用K型多层板框过滤至澄清，按总量的0.1％加入饱和甲醛水溶液于上述滤液中，充分搅拌混匀，室温放置24h，期间振摇数次，过滤除菌，用截留分子量为1000KDa的超滤膜过滤除病毒，得到提纯的蛋黄抗体，即TGEV、PEDV二联蛋黄抗体；

(4)将提纯的蛋黄抗体液冻干贮存

3.根据权利要求2所述的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体的制备方法，其特征在于所用猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的病毒含量都≥10^6.0TCID₅₀/ml。

4.根据权利要求2所述的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻病毒二联蛋黄抗体的制备方法，其特征在于TGEV抗原的制备程序是：将传染性胃肠炎病毒液接种3瓶PK15细胞，瓶底面积25cm²，每瓶细胞接种1ml病毒液，盖好瓶盖，横卧瓶管轻轻转动，使病毒液与整个细胞单层充分接触，37℃吸附40min，其间每隔10min晃动1次，无需吸弃病毒液，直接加含2％胎牛血清的DMEM细胞维持培养液5ml，同时设立细胞对照，37℃ CO₂培养箱中培养；24h后倒掉维持液进行换液，逐日观察细胞病变，若72h后感染细胞病变(CPE)不明显，则收获细胞悬液-20℃～20℃反复冻融3次后在4℃条件下3000rpm离心30min取上层清液继续在细胞上盲传，盲传至第二代出现细胞病变，至75％细胞出现细胞病变时收毒，-20℃～20℃反复冻融3次，然后在4℃条件下，3000rpm离心30min，除去细胞碎片，收集上层清液，浓缩后用作抗原。