[发明专利]抗体单价化多聚标记法生产的竞争免疫检测试剂盒及其使用方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种竞争免疫法检测小分子的试剂盒及其使用方法和应用，具体的说是一种抗体单价化多聚标记法生产的竞争免疫检测小分子的试剂盒及其使用方法和应用。

背景技术

小分子(是指由于分子量小或抗原结合位点少难于用双抗体夹心法检测的分子)免疫检测往往采用竞争法进行，该方法首先将抗体固定于固相载体，通过小分子标记酶(如辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶)-底物，荧光标记物(如异硫氰酸荧光素(FITC)，异硫氰酸罗丹明(TRITC)等)或者其他标记物等信号呈现系统来实现测量或者测定小分子的目的(方法一，参见图1)。这种测定或测量模式中，首先需要得到小分子与标记物的结合物，而小分子标记物结合物一则在制备上不如抗体-标记物结合物简便，二则其纯化亦颇为困难，结合有小分子的酶与游离酶之间难于分离；另外这种方法所存在的弊端是，在具体实验操作中游离小分子(小分子标准品或待测样品)与小分子标记物难以同步加入，由此造成不同平行组间，两者加入之间的时间差很难控制，这样先加入的小分子优先与固定化的抗体结合，优先占据抗体的抗原结合位点，后加入的小分子标记物所能拥有能够结合的位点多少也不同，这样就容易造成竞争不同步的问题，竞争法免疫检测的信号与待检样品的含量本来就是呈现的是反向相关性，误差大，再加上以上所谓的人为操作误差将大大降低检测产品的测量准确性。

国外有些公司为了解决这个问题，先在固相载体上固定一个抗Fc片断的抗抗体，在实验过程中先后分别加入游离的小分子(标准品或待检样品)和小分子-载体蛋白-标记物复合物，最后加入针对小分子的特异性抗体，抗体加入以后，游离的小分子(标准品或待检样品)和小分子-载体蛋白-标记物复合物同时与针对小分子的特异性抗体同步竞争结合，针对小分子的特异性抗体被固定在固相载体上的抗Fc片断的抗抗体结合捕捉下来，最后通过信号呈现系统记录数值(方法二，参见图2)。这种方法的不足是：抗体用量大，而且要先包被抗Fc片断的抗抗体，试剂盒生产和使用步骤繁琐；只有抗小分子特异性抗体同时与抗Fc抗抗体和小分子-蛋白载体-标记物复合物同时结合才能捕捉记录为有效信号，这种检测方法的敏感性不高。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述传统技术问题，提供一种误差小、检测限度高、竞争法实验的线性曲线的线性系数高的检测试剂盒及其应用。

本发明的另一目是提供上述检测试剂盒的使用方法。

本发明检测试剂盒包括固相载体、小分子标准品、标记物复合物，所述固相载体为固定有小分子-载体藕联物的固相载体，所述标物物复合物为单价抗体-多聚标记物复合物。

所述单价抗体-多聚标记物复合物由下述方法制备而成：(1)特异性抗体单价化及单价抗体的纯化：用木瓜蛋白酶消化抗体成Fc片断和Fab片段，制备抗Fab片段抗体的Sepharose柱，通过亲和层析方法纯化Fab片段，得到单价化抗体片断；(2)标记物与多聚载体的藕联，按照标记物的本身特性与载体藕联，让其在其载体上形成多聚或者串珠结构，得到多聚标记物；(3)将步骤(1)中得到的的单价化抗体片断与步骤(2)中得到的多聚标记物按照1∶1藕联得到单价抗体-多聚标记物复合物。

所述固定有小分子-载体藕联物固相载体由下述方法制成：先将载体蛋白与小分子藕联得到小分子-载体藕联物，然后将其包被或者藕联到固相载体上得到固定有小分子-载体藕联物固相载体。

步骤(2)中所述多聚载体为多聚赖氨酸，葡聚糖或聚乙二醇。

为了解决现有技术中的不足，本发明考虑直接在固相载体上包被小分子-载体藕联物，然后将标记物直接标记在抗体上形成单价抗体-多聚标记物复合物；这样在操作时就很容易实现游离小分子(小分子标准品或待测样品)与小分子藕联物与抗体的同步竞争反应(原理见图三)。

但是通常抗体有两个结合位点，很容易与游离小分子(小分子标准品或待测样品)和固定在固相载体上的小分子-载体藕联物同时结合，但是由于本试剂盒是反相竞争免疫检测法，增加了信号值就相当于减低小分子标准样品或者待测样品的含量，从而严重影响测试的准确性，因此必需使抗体单价化。

为达到上述目的，发明人采用了如下方法制备标记物复合物：将抗体经过单价化处理后与经多聚载体藕联的标记物共价结合，通过控制单价抗体与多聚酶的比例1∶1，保证每个单价抗体-多聚酶复合物中只有一个单价抗体。所述抗体的单价化处理可以采用木瓜蛋白酶切割成Fab片断或者通过基因工程生产单链抗体。