[发明专利]利用物理、化学诱变产生一株稳定高产磷脂酶D的菌株

说明书

技术领域

本发明属于微生物诱变技术领域，涉及到利用物理、化学诱变产生一株稳定高产磷脂酶D的菌株。

背景技术

天然磷脂是良好的天然表面活性剂，但由于结构和组成的原因，其应用范围受到很大限制。为了改善磷脂的性能，人们通过磷脂改性技术研制和开发新型磷脂产品。具有特殊生理功效的改性磷脂商业价值高、市场前景广阔，这也使得磷脂的改性成为目前国内外研究的热点，人们尝试用各种方法对磷脂进行改性研究。

由于磷脂结构的相似性，使得一般的物理化学改性方法难以制备高纯度的单一磷脂，如目前利用溶剂分提得到的磷脂产品纯度低，溶剂消耗量大，且生产成本高，产品溶剂残留也大。新兴的生物技术改性磷脂方法即磷脂的酶法改性与传统改性方法相比有着一些独特的优势，如生物酶法改性具有更好的反应特异性、温和的反应条件以及更少的环境污染等。利用磷脂酶改性可获取高纯特定脂肪酸结构的磷脂产品(结构磷脂)，这些特殊结构的磷脂在自然界中含量极少，难以用化学方法合成，但容易用酶法改性获得。酶法改性生成的磷脂可保持其天然构型，一般可省去分离步骤。但目前磷脂及其衍生物的酶法改性和合成技术大多还处在实验室阶段，磷脂酶活性低、成本高是磷脂改性规模化的主要瓶颈。

磷脂酶D(PLD，EC 3.1.4.4)是作用于磷脂分子中磷酰氧键(P-O)的一类酶，可催化发生两种反应：其一，水解磷脂生成磷脂酸和羟基化合物；其二，当有另一种含羟基的化合物存在时，可催化其结合到磷脂的碱基上，形成新的磷脂，此为PLD的转磷酯化反应或碱基交换反应。在磷脂的酶法改性和稀有磷脂生产领域，PLD有着重要的作用。PLD是在生物膜、脂质体、药物的研究中对磷脂进行结构修饰的关键性工具酶，它可催化制备自然界稀少、难以分离提纯的单体磷脂及磷脂衍生物，如：磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)等，在食品及医药行业的应用中起着重要的作用，因此，PLD来源和制备方法研究是目前一个很活跃的领域。

PLD主要来源于动植物和微生物，尽管来源比较广泛，但是由于含量低，分离提纯工艺复杂，且活力也不高，导致PLD价格昂贵，限制了PLD的广泛应用。PLD的活性、稳定性和选择性是影响磷脂酶工业应用的重要因素，但由于PLD生产技术的不成熟，使PLD的稳定性和反应选择性不能得到保证，目前获得高产PLD的菌株是解决这些问题的关键。天津科技大学的李斌等利用表达载体pET-22b(+)，实现了色褐链霉菌PLD基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的高效表达，并利用镍亲和柱对表达产物进行纯化，但重组PLD酶活力较低，目前还无法实现规模化生产。

获得相对高产菌株的方法主要是通过诱变来实现的，常用的方法主要有紫外诱变、化学诱变等。紫外诱变是一种使用时间长、效果好、设备简单、值得推广的诱变方法，大约有80％的高产抗生素产生菌都曾经用过紫外诱变方法。西北大学的郭浩对其筛选出的链霉菌进行紫外诱变，所得诱变菌产PLD酶活为0.055U/mL，酶活较低。低温等离子体诱变作为一种新型诱变方法，被用于微生物诱变。低温等离子体的电离率较低，电子温度远高于离子温度，离子温度甚至可与室温相当，且低温等离子体中存在着大量的种类繁多的活性粒子，比通常的化学反应所产生的活性粒子种类更多、活性更强，因此，近20多年来该技术在灭菌和生物诱变方面的应用已引起人们的广泛关注。大连理工大学对等离子体诱变做了大量研究，侯英敏、李爽、董晓宇等分别对大气压冷等离子体介质阻挡放电法对产1，3-丙二醇的克雷伯氏菌进行诱变研究，筛选出不同目的的诱变菌株，取得了良好的效果。因此本实验在利用紫外和氯化锂复合诱变的基础上也利用大气压冷等离子体介质阻挡放电法对产PLD的色褐链霉菌进行诱变育种。低温等离子体在密闭的放电室中产生，断电后消失，无任何残留物，其发生装置简单，易于操作，因而具有安全、无污染等特点。

发明内容

本发明的目的是利用物理、化学诱变产生一株稳定高产PLD的菌株，解决现有技术PLD酶活较低、价格昂贵的问题，为PLD进一步规模化生产及应用奠定基础。

本发明的技术方案是利用物理、化学诱变产生一株稳定高产PLD的菌株，其特征是：以色褐链霉菌(Streptomyces chromofuscus)CCGMC 4.331为出发菌株，将其单孢子菌悬液依次进行“紫外线和氯化锂复合诱变→大气压冷等离子体和氯化锂复合诱变”，最后得到一株高产PLD的色褐链霉菌，用于发酵制备PLD。

步骤1

将出发菌株CCGMC 4.331进行紫外线和氯化锂复合诱变，包括以下步骤：

(1)制备菌悬液