[发明专利]BRAF基因突变检测特异性引物和液相芯片

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及BRAF基因突变检测特异性引物和液相芯片。

技术背景

鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1(v-taf mourine sarcoma viral oncogene homolog B1，BRAF)基因，定位于人染色体7q34，其具有功能的编码区由2510对碱基组成，编码MAPK通路中的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，该酶将信号从Ras转导至MEK1/2，从而参与调控细胞内多种生物学事件。研究表明，BRAF主要有两种突变类型：①11％的突变位于外显子11上的甘氨酸环，如G463、G465、G468等点突变；②89％的突变发生于外显子15上的激活区，其中约92％位于第1799位核苷酸上(T突变为A)，导致其编码的谷氨酸由缬氨酸取代(V600E)。

目前，已经建立的BRAF基因突变检测技术，主要是PCR-测序法和实时荧光定量PCR检测技术。PCR-测序法具有能够确定突变范围和类型的优点，是目前应用较为广泛的检测方法，但测序法的灵敏度只有20％-25％，远远不能满足实际应用的需要，尤其是对于异质性的肿瘤体细胞突变，低灵敏度将导致大量的漏检。同时，测序法检测操作复杂，时效性差，对于要求高时效性和高灵敏度实际应用检测，测序法的局限性早已凸显。而实时荧光定量PCR检测技术，其检测效率高，时效性强，但其高居不下的假阳性率也为实际应用所诟病。基于上述检测技术存在的问题，申请人前期成功开发的“BRAF基因突变的检测探针、液相芯片及其检测方法”(申请号：200910037357.6)检测方法操作简单，通过酶切富集排除了大量野生型序列造成的干扰，结果特异性好，灵敏度高，准确度达99％以上，但该方法涉及两轮PCR操作，较易造成污染，且杂交检测步骤探针较为接近(只有突变位点不同)，不便于多种基因突变位点并行检测。

发明内容

本发明的目的之一是提供BRAF基因突变检测液相芯片。该液相芯片可用于检测BRAF基因的正常基因型和V600E突变型。

实现上述目的的技术方案如下：

一种BRAF基因突变检测液相芯片，主要包括有，

(A)针对BRAF的V600E突变位点，分别设计的野生型和突变型的一对ASPE引物：每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物组成，所述tag序列选自SEQID NO.25-SEQ ID NO.30中的任2种序列；所述特异性引物是来源于SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2或其反向互补序列SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14中的碱基序列，且特异性引物的3’端的最后3位碱基中的一个碱基为突变位点，所述特异性引物的Tm值在52～58℃之间；

(B)分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的2种微球，所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.31～SEQ ID NO.36中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；

(C)用于扩增具有V600E突变位点的BRAF基因目标序列的扩增引物。

优选地，所述扩增引物为SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38。

优选地，所述野生型的特异性引物为SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.7中的一条，所述突变型的特异性引物为SEQ ID NO.8～SEQ ID NO.12中的一条；或所述野生型的特异性引物为SEQID NO.15～SEQ ID NO.19中的一条，所述突变型的特异性引物为SEQ ID NO.20～SEQ IDNO.24中的一条。

优选地，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述间隔臂序列为5-10个T。

本发明的另一目的是提供一种用于BRAF基因突变检测的特异性引物。

具体技术方案如下：

用于BRAF基因V600E突变检测的特异性引物，所述特异性引物是来源于SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2或其反向互补序列SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14中的碱基序列，且特异性引物的3’端的最后3位碱基中的一个碱基为突变位点，所述特异性引物的Tm值在52～58℃之间。

本发明的主要优点在于：

1.本发明所制备的BRAF基因突变检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应，可实现多个突变位点的并行检测。