[发明专利]检测氯丙嗪的时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

一种检测氯丙嗪(CPZ)的试剂盒及其检测方法，属于时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)技术领域，用于对尿液、组织、饲料等样品中氯丙嗪的含量检测。

背景技术

氯丙嗪是吩噻嗪类代表药物，这种药主要在肝脏代谢，易产生药物残留，残留的氯丙嗪和部分具有原药活性的代谢物能引起白细胞减少和粒细胞缺乏症，从而引起人体肝脏、肾脏的病变，还会引起眼部并发症等。

目前有关动物源性食品中氯丙嗪及其代谢物的测定方法主要为理化检测法，如用GC-MS测定猪肝中的氯丙嗪残留量，检出限为1ug/kg，用高效液相色谱法测定饲料中的氯丙嗪残留量，检出限为0.05mg/L。固相微萃取(SPME)-气相色谱法，检出限为0.84ug/L。但这些方法仪器设备昂贵，操作复杂，灵敏度低，且不适用于大批量样品的检测，无法满足国内食品安全检测市场的迫切需要。而时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)由于其特异性强、灵敏度高、操作简便、廉价，且特别适于大批量样品的检测等优点而越来越被人们所重视和采用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测CPZ的试剂盒及其检测方法，用于对尿液、组织、饲料等样品中氯丙嗪含量的检测。本发明主要采用时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)检测CPZ。技术方案：该检测CPZ的试剂盒是由(1)96或48孔包被板，(2)缓冲液，(3)氯丙嗪标准，(4)氯丙嗪的抗体冻干品，(5)铕标记的羊抗鼠抗体，(6)洗涤液，(7)增强液所组成。

本发明测定方法：测定的基础是标记免疫反应。包被有CPZ-OVA的微孔板，加入CPZ标准或已处理好的样品到各自的微孔中，再加入CPZ抗体，振荡反应，游离的CPZ与微孔板上的CPZ-OVA竞争CPZ抗体，洗涤液洗涤，没有连接的CPZ抗体在洗涤步骤中被除去。加入EU3+-羊抗鼠抗体，进行标记免疫反应，再用洗涤液洗涤，反应后没有连接的EU3+-羊抗鼠抗体在洗涤步骤中被除去。加增强液振荡后，在紫外光的激发下发射很强的荧光，用时间分辨荧光仪测定其荧光强度cps，荧光强度与样品中的浓度成反比，对照标准曲线即可确定样品中抗原的量。

附图说明

图1：CPZ-TRFIA反应示意图。

图2：CPZ-TRFIA标准曲线图。

图3：检测氯丙嗪的试剂盒示意图。(1)96或48孔包被板，(2)缓冲液，(3)氯丙嗪标准，(4)氯丙嗪的抗体冻干品，(5)铕标记的羊抗鼠抗体，(6)洗涤液，(7)增强液。

具体实施方案

实施例1

按下列步骤制备试剂盒和检测尿液样品：

(1)Eu3+-羊抗鼠抗体的制备：

取溶解于50mmol/LPBS pH7.0的5g/L羊抗鼠抗体1-2ml，经PD-10柱转换缓冲条件，洗脱液为含0.155mol/LNaCl的50mmol/LNa2CO3-NaHCO3pH8.5缓冲液。收集蛋白峰，经紫外吸收分析定量(1.46A280-0.74A260)，用上述洗脱液稀释羊抗鼠抗体至2g/L。取500-1000μl稀释后的羊抗鼠抗体加入含0.2-0.4mg的Eu3+-N2-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸(Eu3+-DTTA)的小瓶中，30℃磁力搅拌反应20小时。反应液经用80mmol/L Tris-HCl pH7.8缓冲液平衡的Sepharose CL-6B柱(1×40cm)层析，A280监测收集蛋白峰，稀释分装备用。

(2)包被板固相抗原制备：

将CPZ-OVA用50mmol/L Na2CO3-NaHCO3 pH9.6缓冲液稀释至5mg/L的包被液，96(或48)孔微孔板各孔加100μl，4℃放置过夜。弃去包被液，冲洗两次，加150μl含3g/LBSA的上述缓冲液封闭，4℃放置过夜。弃去封闭液，真空抽干，板条密封后置-20℃冷冻保存。

(3)试剂的配制：

A.标准氯丙嗪(CPZ)：(0ng/ml，0.05ng/ml，0.1ng/ml，0.5ng/ml，1ng/ml，5ng/ml)，从CPZ纯品中稀释得到，稀释液为甲醇∶水＝7∶3。

B.缓冲液：8mmol/L NaCl、0.1％BSA、0.2％牛IgG、50μmol/L二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、0.1ml/LTween-80和0.1％NaN3的Tris-HCl pH7.8。

C.洗涤液：14.5mmol/L NaCl、0.2ml/LTween-80和0.2％NaN3的50mmol/L Tris-HCl pH7.8。