[发明专利]温敏型蛋白质分子印迹整体柱及其制备方法和应用

说明书

【技术领域】

本发明属于高分子材料制备技术及其在蛋白质分离分析领域的应用，具体地说涉及一种新型 蛋白质分子印迹整体柱。

【背景技术】

分子印迹技术(molecular imprinting technology)是指制备具有特异性识别作用的客体目标分 子的技术，通常被描述为制造识别“分子钥匙”的人工“锁”技术。基本原理为：提供合适的反 应条件，使模板分子与功能单体相互作用形成超分子复合物，复合物在交联剂及引发剂的作用下 形成聚合物，然后在一定条件下除去模板分子，得到带有与模板分子空间结构互补的识别位点的 分子印迹聚合物(molecularly imprinted polymer，MIP)。由于MIPs具有：构效预定性(structure predetermination)、特异识别性(specific recognition)和广泛实用性(extensive practicability)的优 点，它在色谱中对映体和异构体的分离、固相萃取、化学仿生传感器、模拟酶催化、临床药物分 析、膜分离技术等领域展现了良好的应用前景。

近年来，分子印迹技术逐步拓展到蛋白质的分离、富集、纯化、鉴定等与蛋白质组学 (proteomics)相关的生命科学领域。蛋白质为复杂生物大分子排列，拥有能控制性和特异性地与 目标分子作用并键合的位点，蛋白质(或主体)和配体(或客体)之间的位点互补产生作用力时发生键 合。蛋白质-客体间的相互作用，能够用概念简单的“锁和钥匙”假设来描述，这种假设最贴切实用， 也恰好是分子印迹的基本原理，即模板蛋白周围预组装识别位点，这个过程是分子印迹的基本过 程。在近年蛋白质组学中，以分子印迹作为研究方法已获得越来越多的关注，也取得了一些进展， 分子印迹技术着力于纯化、分离和富集蛋白。目前已有的蛋白质印迹聚合物的方法多限于：包埋 法Pang、表面印迹法Mosbach和抗原决定基法Rachkov。而传统的小分子印迹整体柱的制备技术 并不适合于生物大分子，有关于蛋白质分子印迹整体柱的方法研究鲜有报道。由于蛋白质固有的 特性(体积庞大、构想灵活、结构复杂以及水溶性)，蛋白质印迹的困难集中在如何保持印迹蛋白 质构象的完整性，提高蛋白质印迹聚合物的选择性。

智能高分子水凝胶是一类对外界刺激能产生敏感响应的高分子水凝胶，具有良好的生物兼容 性和智能响应性。根据对外界刺激的响应情况，智能高分子水凝胶分为：温度敏感型水凝胶、pH 值敏感型水凝胶、光敏感型水凝胶、压力敏感型水凝胶、生物分子敏感型水凝胶以及电场敏感型 水凝胶等。其中温度敏感型水凝胶的温度响应机理是指当大分子链上同时具有亲水性的基团和疏 水性的基团时，线型高分子在水溶液中会随着溶液温度的变化而发生分子链构象的变化，由伸展 的无规线团(coil)状转变为蜷曲球(globular)状，这种构象的变化一般认为是亲水作用和疏水作用相 互竞争的结果。温敏型分子印迹聚合物可利用温敏高分子的温度体积相变行为，即在不同温度下 分别发生收缩和溶胀，使得高分子侧链上带有的可与模板分子形成多接触点吸附的功能单体间的 距离和相对位置改变，从而使印迹空腔结合模板分子的亲和力发生改变。温敏型聚合物在蛋白质 印迹方面很有前景，是一种温和高效的分子印迹材料的制备方法。迄今温敏型蛋白质分子印迹整 体柱的制备方法及应用方面的研究在国内外尚未见有关论文或专利报道，在理论上和方法上均属 于创新性研究。

【发明内容】

本发明的目的在于提供一种高选择性及生物兼容性好的蛋白质分子印迹整体柱的制备方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种温敏型蛋白质分子印迹整体柱的制备方法，该方法包括如下步骤：

(a)将两种硅烷化试剂加入到有机溶剂中，混合均匀；

(b)在(a)中加入硝酸作为催化剂，混合均匀；

(c)将(b)液体灌注到毛细管柱或高效液相色谱柱中，模具两端密封，在40℃-50℃垂直放 置12-36小时；

(d)反应结束后，将毛细管柱或高效液相色谱柱分别接入到注射泵或高效液相色谱体系，用甲 醇冲洗柱体，制得毛细管硅胶整体柱骨架或高效液相色谱硅胶整体柱骨架；

(e)将功能单体与交联剂溶于三羟甲基氨基甲烷-盐酸Tris-HCl缓冲溶液中；

(f)在(e)通入氮气除氧后加入模板分子；