[发明专利]一种发酵制备2-KGA的营养强化培养基及其制备2-KGA的方法

说明书

所属领域：

本发明涉及发酵工程与生物技术领域内的一种培养基，尤其是一种发酵制备2-KGA的营养强化培养基，同时本发明还涉及一种应用该强化培养基制备2-KGA的方法。

背景技术

2-酮基-L-古龙酸(2-keto-L-gulonic acid，简称2-KGA)是制备维生素C(L-抗坏血酸)的重要前体。目前工业上主要采用“二步发酵法”工艺。该工艺需要经过两步发酵过程：第一步发酵，以D-山梨醇为底物，经醋酸菌Acetobacter sp.发酵，获得L-山梨糖，第二步发酵，以L-山梨糖为底物，经生酮基古龙酸菌Ketogulonigenium vulgare(俗称小菌)和芽孢杆菌Bacillussp(俗称大菌)两种微生物的混合发酵，获得2-KGA。第一步发酵与第二步发酵联合起来形成了由山梨醇到2-KGA的“二步发酵法”工艺。

“二步发酵法”工艺的主要特点是在“第二步发酵”过程中，由于芽孢杆菌Bacillus sp(俗称大菌)的伴生，普通生酮基古龙酸菌Ketogulonigeniumvulgare(俗称小菌)的生长和2-KGA的产率得到很大提高。混合菌中的大菌没有任何产生2-KGA的能力，其主要作用是辅助小菌生长，小菌是2-KGA的产生菌，大菌对小菌生长和产酸的作用机理仍然没有搞清楚。

本发明通过建立高通量的发酵评价技术平台，对可能辅助小菌生长和产酸的营养物质进行了大规模筛选，首先发现了谷胱甘肽对于小菌产酸的活性，并将这一发现共享给天津大学，天津大学做了后续研究，发现了含巯基化合物对小菌的生长刺激作用，并申请了专利(200910069697.7)。随后发现，原儿茶酸(3，4-二羟基苯甲酸)具有刺激小菌生长产酸的活性.进一步又发现琥珀酸、L-苹果酸、延胡索酸、草酰乙酸，具有明显促进小菌生长和产酸的功能，其促进作用达到或超越了芽孢杆菌的伴生效果。总结这些化合物的特征，与三羧酸循环关系密切四碳二羧酸效果较好，但是，除了这些四碳二羧酸之外，含有一些有机物，例如原儿茶酸，丁二醇，也具有促进小菌生长和产酸的活性。

(1)琥珀酸，又称1，4-丁二酸，分子式C₄H₆O₄，分子量118，白色结晶或结晶粉末，是一种具有广泛用途的有机化工原料，主要用于制备琥珀酸酐、醇酸树脂、油漆、染料、食品调味剂等，医药工业中可用它生产磺胺药、维生素A、维生素B等抗痉挛剂、松痰剂、利尿剂和止血药物，还可用于生产润滑剂和表面活性剂的原料。在生物体内，琥珀酸是三羧酸循环的重要中间产物，经由α-酮戊二酸脱羧、或者异柠檬酸裂解而来，琥珀酸脱氢可形成延胡索酸。

(2)延胡索酸，又称反丁烯二酸、富马酸，分子式C₄H₆O₄，分子量116，无色晶体，用于生产不饱和聚酯树脂、粘合剂、增塑剂等，是精细化学品的中间体，在医药工业中用于解毒药二巯基丁二酸、反丁烯二酸铁的生产，也可作为一种食品添加剂。在生物体内，延胡索酸是三羧酸循环的重要中间产物，它来自琥珀酸的脱氢，经过水合后产生L-苹果酸。

(3)苹果酸，又称2-羟基丁二酸，分子式C₄H₆O₅，分子量134，由于分子中有一个不对称碳原子，有两种立体异构体。自然界中以D-苹果酸、L-苹果酸和DL-苹果酸三种形式存在。最常见的是L-苹果酸，存在于不成熟的的山楂、苹果和葡萄果实的浆汁中，易被人体吸收。L-苹果酸可用于食品添加剂、化妆品、保健品、饲料添加剂等，也可用于治疗肝病、贫血等多种疾病。在生物体内，L-苹果酸是三羧酸循环的重要中间产物，由延胡索酸水合后产生，经脱氢后形成草酰乙酸。

(4)草酰乙酸，又称2-氧代丁二酸，2-羰基丁二酸，分子式C₄H₄O₅，分子量132，是三羧酸循环的一个中间产物。可以在苹果酸脱氢酶的催化下由苹果酸生成，或在丙酮酸羧化酶的作用下，由丙酮酸与CO₂生成，另外，也在转氨酶(EC2.6.1.1)的作用下由天冬氨酸生成，目前主要用于化学试剂。